Сучасні молекулярно-генетичні методи досліджень

Молекулярно-генетичні методи досліджень спадковості людини працюють переважно з молекулами ДНК і білків. Вони використовують біохімічні властивості цих молекул, у першу чергу те, що ДНК і білки є біополімерами. їх широко використовують у різноманітних наукових дослідженнях та в медицині.

Сучасні молекулярно-генетичні методи можна умовно поділити на кілька груп:

• виокремлення й очищення потрібних молекул,

• ампліфікація (копіювання) ДНК,

• гібридизація,

• обробка даних і моделювання.

Зазвичай усі ці методи використовують у комплексі. До найбільш поширених технологій зараз належать секвенування ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, генетичні маркери та ДНК-мікрочіп.

Секвенування ДНК

Метод секвенування ДНК полягає у встановленні послідовності нуклеотидних основ (аденіну, тиміну, гуаніну й цитозину) на певній ділянці ДНК для подальшої ідентифікації такої ділянки і встановлення складу РНК та білків, які можуть бути на ній закодовані. Кількість нуклеотидних основ у ДНК еукаріотів дуже велика, тому її визначають за допомогою спеціальних приладів — секвенаторів (мал. 28.1), які здійснюють цей процес автоматично. Це дозволило в процесі реалізації проекту «Геном людини» здійснити секвенування ДНК всіх хромосом людини, хоча загальний розмір її геному становить 3,2 мільйярди пар нуклеотидів.

Мал. 28.1. Секвенатор — прилад для здійснення секвенування ДНК

Секвенування ДНК широко використовують для діагностики спадкових захворювань і в судовій медицині для встановлення осіб або ідентифікації біологічного матеріалу.

Полімеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є методом, завдяки якому можуть більш ефективно працювати всі інші технології роботи з ДНК. Її головне завдання — збільшити кількість молекул ДНК, необхідних для їх аналізу. Якщо молекул досліджуваної ДНК для аналізу замало, то з допомогою ПЛР їхню кількість можна збільшувати в мільйони разів. І вже після цього можна аналізувати цю ДНК за допомогою будь-якого методу.

ПЛР використовує принцип комплементарності ДНК. Цю реакцію здійснює фермент полімераза, який в клітині здійснює процес реплікації. Він прикріплюється до позначеного місця на нитці ДНК і синтезує копію однієї з її ділянок. Для позначення місця, де полімераза починає синтез, використовують спеціальні коротенькі ланцюжки ДНК — праймери, які визначає дослідник.

Після синтезу спочатку підвищують температуру розчину. Висока температура руйнує водневі зв’язки, завдяки чому старий і новий ланцюги ДНК розходяться. Полімераза в цей час не працює. Потім температуру знижують і полімераза знову може працювати. Після цього починається новий цикл синтезу, але тепер уже на двох ланцюгах ДНК (мал. 28.2). Після повторення цього циклу 30-40 разів кількість ДНК стає достатньою для аналізу, навіть якщо спочатку зразок містив лише одну молекулу ДНК. Цю технологію широко використовують у діагностиці різних захворювань і в судовій медицині.

Крім того, за допомогою ПЛР вдається вилучати ДНК з кісток уже вимерлих організмів, що дає змогу читати і їхні геноми. Саме так було прочитано геном неандертальця.

Мал. 28.2. Схема полімеразної ланцюгової реакції

Застосування генетичних маркерів

Метод генетичних маркерів полягає в ідентифікації певних генів, ділянок ДНК, хромосом або окремих особин виду за допомогою притаманних лише їм сполучень нуклеотидів. Генетичні маркери (або ДНК-маркери) — це поліморфні (ті, які мають кілька варіантів) ознаки, які виявляють на рівні нуклеотидної послідовності ДНК під час здійснення досліджень. Таким чином визначають, які з варіантів маркерів є у певних особин популяції, і завдяки цьому можна встановити структуру та історію цієї популяції та порівняти її з іншими популяціями.

Найчастіше для виявлення генетичних маркерів застосовують секвенування ДНК і полімеразну ланцюгову реакцію.

Генетичні маркери можуть розташовуватися в екзонах або інтронах структурних чи регуляторних генів. Вони можуть траплятися і в некодуючих ділянках геному людини, якими є інвертовані повтори, мікросателітні локуси тощо.

Ці маркери широко використовують в популяційних дослідженнях. їх вивчення дозволяє встановити родинні зв’язки різних популяцій людей та їхню історію розвитку (включаючи міграції та схрещування з іншими групами).

ДНК-мікрочіп

Метод ДНК-мікрочіп визначає, які саме з генів у клітині працюють. Крім того, він дозволяє оцінити й рівень активності генів (який із них працює більш, а який менш інтенсивно).

Суть методу ДНК-мікрочіп полягає в тому, що на спеціальній платі розташовується (за допомогою складного роботизованого механізму) велика кількість зондів — невеликих молекул ДНК, з якими взаємодіють молекули РНК, що наявні у досліджуваних клітинах (мал. 28.3). Зондами можуть бути гени як усього геному (на одній скляній платі їх можна розмістити до 40 тисяч), так і певної його частини, яка задіяна у дослідженні. Місце кожного із зондів на платі чітко визначено, що є дуже важливим для здійснення аналізу взаємодії молекул РНК із зондами, бо такий аналіз здійснюється автоматично за допомогою спеціального пристрою.

Мал. 28.3. Розміщення ДНК-зондів на скельці

Мал. 28.4. Взаємодія зонду і молекули РНК на мікрочипі

Мал. 28.5. Результат методу ДНК-мікрочіпу — виявлено комплекси РНК і ДНК-зондів

Усі РНК досліджуваних клітин мітять спеціальними сигнальними молекулами, які забезпечують їхнє забарвлення. Якщо досліджувані клітини зруйнувати і вилити отриманий розчин на поверхню плати, то всі РНК будуть взаємодіяти із зондами, що їм відповідають (мал. 28.4). Після промивки плати, коли всі зайві молекули будуть видалені, лазерний детектор легко знайде сигнальні молекули, що прикріплені до молекул РНК, які зчепилися із зондами відповідних генів, і можна буде визначити, які гени в клітинах працювали (мал. 28.5).

Така технологія дозволяє, наприклад, встановити, які гени в раковій клітині працюють, а які ні, порівняно зі здоровою, або які саме гени «вимикаються» (перестають працювати) або змінюють свою активність у разі певного спадкового захворювання.

Отже, тепер ви знаєте

1. Які молекулярно-генетичні методи використовують під час вивчення спадковості людини? 2. Що таке секвенування ДНК? 3. Як здійснюють полімеразну ланцюгову реакцію? 4. Навіщо потрібні генетичні маркери? 5*. Складіть список обов’язкових компонентів розчину, в якому можна здійснити полімеразну ланцюгову реакцію.

Запитання та завдання

6. На конкретних прикладах поясніть, як методи молекулярної генетики можна використати в судовій медицині. 7*. Запропонуйте спосіб використання методу ДНК-мікрочіп для порівняння активності роботи одного гена в двох різних тканинах.