Стовбурові клітини
Реферат
Стобурові клітини
1.1. Стовбурові клітини. Кров містить багато типів клітин, що виконують зовсім різні функції: від транспорту кисню до вироблення антитіл. Деякі з цих клітин функціонують виключно в межах кровоносної системи, а інші використовують її лише для транспорту, а свої функції виконують в інших місцях. Однак життєвий цикл всіх клітин крові деякою мірою схожий. У всіх них час існування обмежений, і вони безперервно утворюються протягом усього життя людини. І, наприкінці, суттєвим є те, що всі вони походять від одного того ж типу стовбурових клітин кісткового мозку. Таким чином, ця гемопоетична, або кровотворна, стовбурова клітина плюрипотентна, оскільки дає початок усім видам термінально диференційованих клітин крові [1].
Клітини крові можна розділити на червоні і білі – еритроцити і лейкоцити. Еритроцити залишаються в межах кровоносних судин і переносять О2, зв’язаний з гемоглобіном. Лейкоцити борються з інфекцією, а також поглинають і перетравлюють залишки зруйнованих клітин і т.п., виходячи для цього через стінки капілярів в тканини. Крім цього, в крові у великих кількостях містяться тромбоцити, що являють собою не звичайні цілі клітини, а дрібні клітинні фрагменти, або “міні-клітини”, що відокремилися від кортикальної цитоплазми великих клітин, що називаються мегакаріоцитами. Тромбоцити специфічно прилипають до ендотеліальної вистилки уражених кровоносних судин, де допомагають у відновленні їх стінки і беруть участь у процесі згортання крові. Різні типи клітин крові і їх функції наведено в табл.1.
В той час як кожен еритроцит схожий на всякий інший еритроцит, а тромбоцит на інший тромбоцит, лейкоцити поділяються на ряд різних класів, На основі морфологічних особливостей, які видно в світловий мікроскоп, їх традиційно поділяють на три головні групи: гранулоцити, моноцити і лімфоцити. Всі гранулоцити містять численні лізосоми і секреторні гранули, і отримали свої назви за відмінний характер забарвлення цих гранул. Різниця в забарвленні відображує важливі хімічні і функціональні особливості. Нейтрофіли (які називать також поліморфноядерними лейкоцитами через багатодільні ядра) найчисленніші з гранулоцитів, захоплюють, вбивають і перетравлюють мікроскопічні організми, особливо бактерії. Базофіли виділяють гістамін (а у деялих видів серотонін), який бере участь у запальних реакціях. Еозинофіли допомагають у руйнуванні паразитів і впливають на алергічні реакції.
Моноцити, виходячи з кров’яного русла, стають макрофагами, які поряд з нейтрофілами є головними “професіональними фагоцитами”. Обидва типа фагоцитів містять спеціалізовані органели, які зливаються з новоутвореними фагоцитозними гранулами (фагосомами) і атакують поглинуті мікроорганізми за допомогою високореактивних молекул супероксида (О2) і гіпохлорита (НОСІ), а також концентрованої суміші лізосомних гідролаз. Макрофаги, однак, значно більші за розмірами і довше живуть, ніж нейтрофіли, а до того ж мають унікальну особливість перетравлювати великі мікроорганізми, такі як найпростіші.
Табл. 1*
Тип клітин | Головні функції | Нормальний вміст в крові людини (в 1 л)
Еритроцити | Транспортують О2 і СО2 | 5 х 1012
Лейкоцити 1.Гранулоцити
а)нейтрофіли
(поліморфноядерні лейкоцити)
б)еозинофіли
в)базофіли
2.Моноцити
3.Лімфоцити
а)В-клітини
б)Т-клітини
4.Клітини-кіллери
(NK-клітини) |
Фагоцитують і руйнують бактерії
Руйнують більші паразитичні організми і впливають на алергічні запальні реакції
Виділяють гістамін і серотонін при деяких імунних реакціях
Стають макрофагами в тканинах, де фагоцитують і переварюють бактерії, інорідні тіла і старіючі клітини
Виробляють антитіла
Вбивають клітини, інфіковані вірусом, і регулюють активність інших лейкоцитів
Вбивають клітини, інфіковані вірусом, і клітини деяких пухлин
|
5 х 109
2 х 10 8
4 х 107
4 х 108
2 х 109
1 х 109
1 х 108
Тромбоцити | Ініціюють згортання крові | 3 х 1011
* Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В 3-х томах. Т.3. – М.: Мир, 1994. С.179.
Лімфоцити беруть участь у імунній відповіді і представлені двома головними класами: В-лімфоцити виробляють антитіла, а Т-лімфоцити вбивають клітини, інфіковані вірусом, і регулюють активність інших лейкоцитів. Крім того, існують лімфоцитоподібні клітини, що називаються природними кіллерами, які здатні вбивати деякі види пухлинних та інфікованих вірусом клітин.
Утворення клітин крові (гемопоез) піддається складному контролю, при якому кількість клітин кожного типу регулюється індивідуально, відповідно до зміни потреб організму.
На вершині ієрархії кліти-попередників знаходиться клітина, що дуже рідко зустрічається – плюрипотентна стовбурова клітина. Ця клітина внаслідок сохастичного процесу самооновлюється або диференціюється в одному з трьох напрямків: в мієлоїдну стовбурову клітину, в клітину-попередник, якій судилося стати В-клітиною в кістковому мозку, або в клітину, яка зазнає Т-клітинного диференціювання в тимусі. Мієлоїдні стовбурові клітини можуть в подальшому диференціюватися в родоначальників еозинофільного ряду, в клітини, що мають здатність розвиватися у трьох напрямках – по еритроїдному, мегакаріоцитарному або базофільному, або стати родоначальниками фагоцитів. Ці мультипотентні родоначальники в підсумку диференціюються в уніпотентні комітовані клітини. Вони стають клітинами-попередниками, які під дією гемопоетичних ростових факторів, специфічних для конкретних клітинних ліній, перетворюються на морфологічно розрізнені кровотворні клітини.
Різні типи кров’яних клітин і їх найближчих попередників у кістковому мозку можнаі впізнати за зовнішнім виглядом. Вони перемішані один з одним, а також з жировими клітинами і фібробластами, що утворюють ніжну опорну сітку колагенових волокон та інші компоненти позаклітинного матриксу. Крім того, вся тканина пронизана тонкостінними кровоносними судинами (кров’яними синусами), в які переходять новоутворені клітини крові. Є також мегакаріоцити; на відміну від інших кров’яних клітин вони залишаються в кістковому мозку і після дозрівання, складаючи одну з найпомітніших гістологічних особливостей цієї тканини; вони надзвичайно великі (до 60мкм в діаметрі) і мають високополіплоїдне ядро [1,4]. В нормальних умовах мегакаріоцити обліплюють стінки кров’яних синусів і протягують свої відростки через отвори в їх ендотеліальній вистелці; від цих відростків відокремлюються тромбоцити, які потім відносить кров.
1.2. Ростові фактори та механізм їх дії. Кровотворна система знаходиться під контролем ростових факторів, що виробляються не лише у кістковому мозку, а й в усіх тканинах. Вони працюють у тісному зв’язку для забезпечення стабільного гемопоезу і задовільнення неочікуваних вимог у кровотворних клітинах шляхом підвищення їх продукції в одному чи багатьох кровотворних компартментах.
Дотепер відомо вже не менше 20 факторів росту гемопоетичних клітин, з яких найкраще вивчено фактор стовбурових клітин (SCF, C-kit ligand), інтерлейкін 1 (ІL-1), ІL-3, ІL-6, ІL-11, гранулоцито-моноцитарний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), гранулоцитарний колонієстиму-
люючий фактор (G-CSF), моноцитарний колонієстимулюючий фактор (М- CSF), фактор, що стимулює ріст і розвиток еритроїдних попередників – еритропоетин, фактор росту і розвитку мегакаріоцитів, або тромбопоетин. Відомі також інгібітори гемопоезу – макрофагальний протеїн-1 і фактор,що пригнічує гранулопоез – трансформуючий ростовий фактор [цит. по 2].
Рецептори ранніх ростових факторів широко представленні на кровотворних клітинах. Вони були знайдені на плюрипотентних стовбурових клітинах, частково і повністю комітованих клітинах-попередниках. Точне розподілення рецепторів до пізнодіючих ростових факторів невідомe, але вважають, що вони експресуються на комітованих попередниках, а саме: еритропоетиновий рецептор може бути експресований тільки на попередниках, які комітовані до еритроїдного диференціювання. Еритропоетинові рецептори продовжують експресуватися на проеритробластах і базофільних еритробластах. Макрофаги мають рецептори до ІL-3, GM-CSF, але не до G-СSF. Еозинофіли мають рецептори до ІL-5, GM-CSF і ІL-3 [3].
Таке розподілення є важливим для клініки гематологічних і онкологічних захворювань, оскільки моноцити, гранулоцити і еозинофіли активуються тими гемопоетичними ростовими факторами, до яких вони мають рецептори. З цієї причини ростові фактори, такі як GM-CSF, ІL-3, високотоксичні при застосуванні їх у якості терапевтичних препаратів, якщо ретельно не контролювати їх дози [3].
Ростові фактори сьогодні міцно ввійшли в клінічну практику, значно розширивши терапевтичні можливості при цілому ряді захворювань.
За остані 20 років спостерігався значний прогрес у лікуванні багатьох злоякісних новоутворень, проте хіміотерапія має високу токсичність, яка накладає обмеження на інтенсивність дози. Це фактор, що до недавнього часу стримував можливість застосовування високодозової хіміотерапії.У зв’язку з цим, невідворотніми є періоди нейтропенії та тромбоцитопенії, що є небезпечним для пацієнтів, оскільки виникають серйозні, а іноді навіть небезпечні для життя, інфекційні та гемостатичні ускладнення, особливо під час застосування високодозової терапії для лікування раку. У зв’язку з цим, інтерес до можливості стимулювання гранулоцитопоеза особливо великий.
Стимуляторами гранулоцитопоеза є кілька факторів росту. Їх дія на мієлопоез тим інтенсивніша і багатогранніша, чим на обмеженіший пул клітин діє той чи інший фактор. Так, ІL-3, що діє на клітини-попередники мієлопоеза, забезпечує їх проліферацію, в той час, як GM-CSF і G-CSF – не тільки проліферацію, але й дозрівання попередників до зрілих гранулоцитів. При цьому G-CSF, діючи лише на попередників гранулоцитопоеза, збільшує число лейкоцитів у крові значно швидше, ніж GM-CSF, оскільки зменшує час дозрівання від попередників до зрілих гранулоцитів із 7 до 1,5 дня і значно активніше, ніж GM-CSF стимулює вихід зрілих гранулоцитів із гранулоцитарного пула кісткового мозку до периферійної крові. Було показано, що видалення гена GM-CSF у миші призводить до зменшення кількості гранулоцитів у крові тільки на 1/10, а внаслідок видалення гена G-CSF кількість гранулоцитів зменшується на 80% [цит. по 2].
2.Використання факторів росту при хворобах системи крові
2.1. Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор. G-CSF було виявлено при вивчені регуляції гемопоезу в дослідах на мишах у 1983 році. Його дію на гемопоетичні клітини вивчали D.Metcalf і N.Nicola. G-CSF людини було вперше виділено в 1985 році із середовища, в якому культивувались клітини карциноми сечового міхура людини. Ген, що кодує утворення G-CSF розміщений на довгому плечі хромосоми 17, яка зазнає перебудови при ряді гематологічних захворювань [цит. по 2].
При вивченні біологічних властивостей G-CSF виявлено, що він стимулює утворення гранулоцитарних колоній in vitro, синергійно з іншими ростовими факторами (ІL-3, GM-CSF, M-CSF) стимулює утворення мегакаріоцитарних, гранулоцитарно-макрофагальних і змішаних колоній in vitro, збільшує виживання і проліферацію незрілих попередників гемопоетичних клітин, стимулює проліферацію комітованих попередників гранулоцитів, а також промієлоцитів і мієлоцитів, вкорочує час розвитку нейтрофільних гранулоцитів від їх попередників, збільшує число попередників гемопоезу в крові, антитілозалежну цитотоксичність, міграцію лейкоцитів і хемотаксис [цит. по 2].
Таким чином, G-CSF діє не лише на попередників гранулоцитопоеза, забезпечуючи їх проліферацію, диференціювання, дозрівання і вихід зрілих гранулоцитів у периферійну кров, але і на зрілі гранулоцити, зумовлюючи збільшення тривалості їх життя, прискорення і збільшення міграцій гранулоцитів до місця запалення, підвищення їх здатності до хемотаксису по відношенню до бактерій і фагоцитозу.
Продуцентами G-CSF є моноцити, фібробласти і ендотеліальні клітини. G-CSF утворюється головним чином у кістковому мозку, але в пренатальному і ранньому натальному періоді – також в печінці і селезінці.
Дія G-CSF відбувається шляхом його зв’язування із строго специфічними рецепторами, які є на гранулоцитарних клітинах всіх стадій дозрівання, але відсутні на клітинах еритроїдного і мегакаріоцитарного рядів. Рецептори до G-CSF є протеїнами, і складаються з одного поліпептидного ланцюга з молекулярною масою 100-150 кДа, що містить у своєму складі в людини 812 або 759 амінокислотних залишків. Є рецептори помірної і високої аффінності. У фізіологічних умовах дія G-CSF відбувається шляхом зв’язування з високоаффінними рецепторами, при збільшенні рівня G-CSF в крові і тканинах відбувається його зв’язування з рецепторами помірної аффінності. На клітинах гранулоцитарного ряду є від 50 до 500 рецепторів на клітину [цит. по 2].
Дія G-CSF відбувається дуже швидко: протягом кількох хвилин після ін’єкції відбувається спочатку зменшення кількості нейтрофілів у периферійній крові, яке пояснюється посиленням адгезії в судинах, що призводить до виходу гранулоцитів із циркуляції, а потім – швидке збільшення кількості нейтрофілів, і протягом 24 годин спостерігається поява незрілих попередників гранулоцитопоеза в периферійній крові.
Досліди на мишах і мавпах продемонстрували, що G-CSF в змозі індукувати нейтрофілію в нормальних тварин і підвищувати відновлення нейтрофілів після використання 5-флорурацилу або загального опромінення організму. Нормальних рівнів нейтрофілів у мавп було досягнуто у межах 10 днів від початку лікування після застосування доз циклофосфаміду, які індукували аплазію. Коли G-CSF починали вводити перед хіміотерапією, рівень нейтропенії був глибшим, проте відновлення не порушувалось. Це вказує на те, що клітини-попередники спонукаються до вступу в клітинний цикл G-CSF, тому стають чутливими до цитотоксичних препаратів [24].
Досліди з Н3-тимідином проводилися для визначення кінетики гранулопоезу людини та мишей після призначення G-CSF. Було показано, що гранулопоез підвищувався на всіх рівнях, а найбільше на рівні мієлобластів. Також очевидним було прискорення дозрівання і виходу клітин, але не спостерігалося ніяких змін у тривалості циркуляції нейтрофілів у кров’яному руслі [цит. по 10].
Можливим є те, що функції нейтрофілів посилюються у пацієнтів, які отримують G-CSF. У них підвищується здатність до хемотаксису, що також забезпечує захист проти різних патогенних факторів, включаючи бактерії та гриби [7].
Перша частина клінічних досліджень продемонструвала, що G-CSF є ефективним у підвищенні числа нейтрофілів при тривалому внутрішньовенному введенні, короткочасному внутрішньовенному введенні та при введенні під шкіру. Навідміну від GM-CSF, вживання G-CSF не супроводжується побічними ефектами. Трапляються скарги на біль у кістках у 20% пацієнтів, підвищення рівня лактатдегідрогенази та сечовини, а також збільшення селезінки у дітей із хронічною нейтропенією. Ці проблеми, як правило, незначні, а біль у кістках легко знімається парацетамолом. Було зафіксовано лише один випадок гострого дерматозу у пацієнта хворого на лейкемію [цит. по 10].
Поряд із дослідженнями ролі та механізмів впливу G-CSF і GM-CSF, необхідними є вивчення патофізіології нейтропенії та сепсису, спричиненого нейтропенією. Було невідомо чи ці проблеми були спричинені неадекватною кількістю нейтрофілів, чи нейтрофіли цих пацієнтів були якісно недосконалими. Схоже на те, що інфекції в таких пацієнтів спричинені комбінацією цих факторів. Окрім того, у пацієнтів з нейтропенією часто розвивається гарячка без ознак джерел інфекції і мікробіологічних підтверджень інфекції. Без сумнівів, що пацієнти з нейтропенією мають підвищений ризик померти від інфекції, і чим вищі дози хіміотерапії та довші її курси, чи застосування комбінації хіміотерапії та радіотерапії, тим вищий ризик [21].
Проблема нейтропенії, що настає після хіміотерапії ракових захворювань розглядалася багатьма вченими. У багатьох клінічних випадках застосування G-CSF спричиняло значне скорочення тривалості нейтропенії. Було відмічено покращення перенесення пацієнтами інфекцій, зменшення кількості грибкових уражень, скорочення періоду перебування пацієнтів у лікарні і можливість призначення вищих доз хіміотерапії [цит. по 10].
Щоб довести, що зменшення періоду нейтропенії спричинено використанням G-CSF, важливо було провести плацебо контрольовані рандомізовані дослідження. Це було зроблено Crawford et al, використовуючи циклофосфамід і доксорубіцин при терапії раку легень. Ці цитотоксини було вибрано через те що вони широко використовуються для лікування різних форм раку. Рак легенів було обрано як модель раку, що піддається хіміотерапії, і лікування якого ускладнюється інфекціями. Досліджувальні ліки давали при кожному циклі хіміотерапії. Цих пацієнтів пізніше лікували введенням G-CSF. Було відмічено 50% зменшення частоти виникнення гострої нейтропенії у пацієнтів, які отримували G-CSF, внаслідок чого зникала необхідність госпіталізації та використання антибіотиків. Пацієнти, які отримували плацебо, після чого почали отримувати G-CSF, після зникнення нейтропенії були в змозі отримувати повну дозу хіміотерапії з підтримкою G-CSF [9].
При синдромі Костмана введення G-CSF спричиняє збільшення числа нейтрофілів у периферійній крові. При циклічних нейтропеніях тривалість циклу може бути вкорочена, і спостерігається збільшення кількості BFU-E (вибух формуючих одиниць еритроцитів) і GM-CFC (гранулоцит-макрофагальних колонієутворюючих клітин). У пацієнтів із глікогенозом типу Ib G-CSF різко підвищує кількість нейтрофілів з подальшим покращенням перенесення інфекцій. Тривала терапія із застосуванням G-CSF забезпечує захист пацієнтів від інфекцій. Єдиним побічним ефектом була спленомегалія. Це можна вважати рідкісним випадком. Спленомегалія виникає лише у дітей із гострою хронічною нейтропенією. Відзначено також підвищення кількості нейтрофілів і відступ інфекції у цих пацієнтів завдяки G-CSF [25].
Мієлодиспластні синдроми є гетерогенною групою захворювань, деякі з яких характеризуються цитогенетичними порушеннями, зумовлених дефектом довгого плеча 5 хромосоми, де знайдено ген, що кодує GM-CSF. Пацієнти знаходяться у ризику померти від кровотеч, інфекцій чи виникнення гострої лейкемії та анемії. У цьому випадку кількість нейтрофілів може бути збільшена завдяки введенню G-CSF, із збільшенням GM-CFC у кістковому мозку без збільшення клональної проліферації. Цитогенетичні порушення можуть зникнути під час лікування (можливо завдяки селективній стимуляції нормальних клонів гемопоетичних клітин), але знову з'являються після припинення введення G-CSF. При лікуванні 18 пацієнтів за допомогою G-CSF, було відзначено збільшення показників нейтрофілів у 16 з них, проте вони повернулися до початкового стану після припинення терапії. Зменшений ризик інфекції було відмічено коли нейтрофілів було > 1.5x109/літр. Не зважвючи на це, у трьох пацієнтів під час терапії мієлоїдна лейкемія прогресувала. Було відмічено, що G-CSF спричиняє збільшення кількості нейтрофілів у дітей, хворих на апластичну анемію, під час терапії, але ці показники поверталися до початкового рівня після припинення введення G-CSF [цит. по 10].
G-CSF i GM-CSF можуть збільшити кількість нейтрофілів у пацієнтів із мієлодисплазією чи апластичною анемією, але це ще повністю не доведено. Може бути, що G-CSF є більш корисним у лікуванні таких пацієнтів під час гострих інфекційних захворювань. Для хворих на мієлодисплазію ризик стимуляції її трансформації у мієлоїдну лейкемію до кінця не визначено.
G-CSF використовувався для лікування лімфобластної та мієлобластної лейкемії. Знову, було відмічено збільшення кількості нейтрофілів, та зменшення ризику інфекції для обох типів лейкемій. Була тенденція до збільшення швидкості ремісії у групі, яка отримувала G-CSF, але це не стало статистичним показником пізніше. Не було жодної різниці між групами щодо відновлення тромбоцитів, виникненням рецидивів чи кількості днів із гарячкою. Не було відновлення росту мієлобластів у групи, що отримувала G-CSF, що свідчить про те, що його безпечно використовувати в цій групі протягом часу проведення хіміотерапії. Ясно, що немає жодних протипоказів щодо використання G-CSF при гострій лімфобластній лейкемії, і йому випадає головна роль у лікуванні таких пацієнтів [21].
G-CSF використовується при аутотрансплантації кісткового мозку, що проводиться для лікування різних немієлоїдних злоякісних новоутворень. Застосування G-CSF спричиняє значне скорочення періоду нейтропенії, і пряму вигоду для пацієнтів, пов’язану з меншим використанням антибіотиків, зменшенням кількості днів із лихоманкою, періоду парентерального годування та періоду перебування у лікарні.
Важливе місце зараз займає G-CSF при зборі стовбурових клітин периферійної крові (СКПК) для їх трансплантації. Ще декілька років тому було показано, що трансплантація СКПК сприяє швидшому відновленню гемопоезу в порівнянні з трансплантацією кісткового мозку. Здатність G-CSF збільшувати вихід стовбурових клітин у кров розширила можливості інтенсифікації терапії з наступним відновленням гемопоезу за допомогою СКПК. Порівняльні досліди показали, що G-CSF сприяє значно активнішому виходу стовбурових клітин у кров, ніж GM-CSF [цит. по 2].
Для збору СКПК з метою їх наступної трансплантації звичайно використовується доза 10 мкг/кг в день, оскільки при цій дозі досягається найбільший вихід стовбурових клітин у кров. Вводять препарат підшкірно [цит. по 2].
2.2. Гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор. Досліди іn vitro показали, що GM-CSF діє як на дозрілі, так і на недозрілі клітини гранулоцитарно-макрофагального ряду, спричинюючи проліферацію клітин-попередників і диференціацію більш зрілих клітин. GM-CSF може активувати багато функцій фагоцитуючих клітин, включаючи хемотаксис, адгезію, фагоцитоз, втрату грануляції, продукцію супероксидних аніонів, антитілозалежну клітинну цитотоксичність та антипаразитарну активність. У досліді на мишах, GM-CSF, що вводився у черевну порожнину, спричиняв ефект підвищення гранулопоезу з акумуляцією дозрілих нейтрофілів і моноцитів, що спостерігалась у печінці та селезінці. GM-CSF людини, який вводили людиноподібним мавпам, спричиняв помітний лейкоцитоз, що зберігався до 28 днів, який давав (без шкідливих ефектів) збільшення кількості нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів і лімфоцитів. Розвивався також незначний ретикулоцитоз. GM-CSF спричиняє однаковий ефект коли його вводять мавпам внутрішньовенозно та підшкірно, проте підшкірний шлях ефективніше викликає лейкоцитоз [13].
GM-CSF є ефективним при введенні нормальним тваринам, а також тваринам, до яких застосовується мієлотоксичне лікування. У мишей, яким давали рекомбінантний GM-CSF шсля мелфалану, спостерігалося вкорочення періоду нейтропенії та зниження загибелі мишей від нейтропенії. Спустошення пулу клітин-попередників гранулоцитів-макрофагів у кістковому мозку і селезінці настає раніше у групи, яка отримує GM-CSF, проте це ще повністю не доведено [14].
Здатність GM-CSF посилювати пpоліферіцію і диференціацію гранулоцитів та макрофагів дає змогу використовувати його в терапії мієлоїдних лейкемій і мієлодиспластних синдромів. Його вплив на функцію нейтрофілів підвищує можливість його використання для збільшення числа нейтрофілів та стимуляції їх функцій у хворих з нейтропенією, а також, можливо, моноцито-мaкрофагальні бактерицидні та протипухлинні властивості. Інші можливі шляхи його використання, що випливають із доклінічних досліджень, базуються на ролі GM-CSF у додатковій терапії інфекційних захворювань, а також його використання у комбінації з іншими цитокінінами для досягнення клінічних відповідей у певних ситуаціях. Наприклад, при апластичних анеміях, пересадках кісткового мозку і для лікування пацієнтів із синдромом набутого імунодифіциту (СНІД) [10].
Ранні дослідження властивостей GM-CSF були утруднені тим, що цей ростовий фактор має видову специфічність. GM-CSF призначався хворим із неоперабельними або метастазними саркомами, у яких був здоровий кістковий мозок. У цих пацієнтів GM-CSF підвищував целюлярність кісткового мозку, спричиняв преферійну нейтрофілію та еозинофілію. Також спостерігалось підвищення кількості клітин-попередників у крові [6].
GM-CSF рідко виявляється в периферійній крові. Проте його було виявлено у хворих із гострими грибковими інфекціями. Схоже на те, що GM-CSF не відповідає за постійний гомеостаз, але може відігравати значну роль у стресових ситуаціях та при запаленнях.
Перша стадія досліджень довела, що результатом введення GM-CSF різними способами є лейкоцитоз, коли переважають нейтрофіли та еозинофіли, а рівень моноцитів підвищений незначно. Підшкірне введення є ефективнішим, ніж внутрішньовенне. На ретикулоцити він не має жодного впливу. Вплив на тромбоцити незначний та мінливий. Мінімум тромбоцитів спостерігається в перші 5 днів лікування у більшості пацієнтів, а максимум досягається в наступні 5 днів [цит. по 10].
Спостерігалася активація моноцитів за допомогою GM-CSF з виявленням ними антипухлинних властивостей in vitro. In vivo було виявлено лише одну часткову відповідь проти солідної пухлини. Це була ліпосаркома, яку до того довго лікували. Пацієнт мав 50% зменшення об’єму пухлини після п’яти циклів GM-CSF. Більше протипухлинних ефектів відмічено не було, хоча вичерпних досліджень у цьому напрямку не проводилось [цит. по 10].
“Ефект першої дози” проявляється при внутрішньовенному введенні GM-CSF. Не пізніше як через 20 хвилин після першої дози у багатьох пацієнтів з’являється рум’янець, біль у спині, посилюється потовиділення, починається тошнота, блювання, невимушені спазми ніг, задишка, розвивається гіпотонія, тахикардія та гіпоксія. Ці реакції з найбільшою частотою зустрічаються у пацієнтів із раком легень та у пацієнтів, яким препарат увели шляхо швидкої внутрішньовенної інфузії. Ці реакції не спостерігалися при продовженні курсу GM-CSF, а виникали лише на початку. Іншими порушеннями, що виникали при високих дозах препарату в першій частині досліджень були тромбози, плевральні та перикардіальні крововиливи, запалення та набряки. При нижчих дозах було відмічено висипи на шкірі, загальна слабкість, в’ялість, втрата апетиту, потіння, біль у м’язах, суглобах, гарячка [цит. по 10].
Порівнюючи результати досліджень, можна дійти висновку, що різні рекомбінантні форми GM-CSF характеризуються різною активністю. Поки що до кінця точно не визначено терапевтичного ефекту препарату. Для цього необхідно провести велике рандомізоване, плацебо контрольоване дослідження, з використанням від чотирьох до шести циклів хіміотерапії.
Перші досліди на людях було проведено в тих ситуаціях, при яких хвороба спричиняла порушення функцій кісткового мозку, наприклад СНІД, мієлодиспластичні синдроми чи після трансплантації кісткового мозку. Завдяки природі цих станів важко бути впевненим, які наслідки виникали завдяки використанню GM-CSF, а які спричиняла сама хвороба. Тим не менше, виявилось, що GM-CSF відіграє певну роль у покращенні нейтрофільних показників при цих станах.
Усі клінічні дослідження, що проводилися з використанням GM-CSF, продемонстрували, що його застосування вкорочує період лейкопенії. Дослідження показали ряд переваг його застосування: скорочувалось застосування антибіотиків, тривалість гарячки, раніше можна було проводити наступний курс хіміотерапії. Наступні дослідження показали зменшення виникнення інфекцій та кількості профілатично перелитих тромбоцитів. Усі ці дослідження становили лише один курс терапії, тому важко екстраполювати результати цілого курсу лікування. Деякі дослідники відмітили збільшення швидкості відновлення тромбоцитів, але це не можна сказати про кожен окремо взятий випадок, і, можливо, немає взагалі жодного впливу на раннє віднoвлення тромбоцитів після застосування GM-CSF.
Нещодавно опубліковано результати подвійного сліпого рандомізованого, плацебо контрольованого дослідження дії GM-CSF у 15 пацієнтів, хворих на рак яєчника, які отримували курси хіміотерапії з карбоплатином та циклофосфамідом. Це було перше дослідження, що оцінило наслідки застосування GM-CSF протягом усього курсу хіміотерапії. Було відзначено, що GM-CSF при всіх дозах збільшує загальну кількість лейкоцитів на 7, 10 та 15 день, у порівнянні з контрольною групою. Кількість нейтрофілів підвищувалась на 7 та 10 день. При найвищій дозі GM-CSF (6 g kg-1 day-1) високий рівень усіх типів лейкоцитів утримувався до 22-го дня. У всіх пацієнтів відмічались позитивні реакції на введення препарату [цит. по 10]. Не можна з упевненістю стверджувати про роль препарату в подаланні інфекції, оскільки було задукоментовано лише один випадок з усієї дослідної групи, до якої входило надто мало пацієнтів, щоб продемонструвати безпечність та переваги призначення GM-CSF при кількох циклах хіміотерапії. Можна спекулювати тим, що отримані вигоди важко продемонструвати, оскільки автор використовував традиційні дози хіміотерапії, що добре переносяться. Вигоди від клінічного застосування GM-CSF не буде остаточно визначено до того часу, поки не буде опубліковано великого рандомізованого дослідження.
У ситуаціях, коли нейтропенія набуває гострої чи хронічної форми, або є вродженою (синдром Костмана), застосування GM-CSF дало змогу збільшити кількість білих клітин крові в більшості пацієнтів. У багатьох хворих переважно підвищується рівень еозинофілів, а не нейтрофілів. Лікування із застосуванням GM-CSF у цих пацієнтів переросло у клінічну вигоду, що пов’язується з подоланням раніше існуючих інфекцій та запобіганням виникнення нових під час хіміотерапії. При синдромі Фелті відмічено роль GM-CSF у індукуванні еозинофілії при незначному збільшенні кількості нейтрофілів, проте не було відмічено ролі препарату в зниженні ризику інфекції у цих пацієнтів [22]. GM-CSF також відіграє роль у лікуванні нейтропенії, спричиненої ліками.
У багатьох дослідженнях вказується роль GM-CSF у підвищенні утворення гранулоцитів при мієлодисплазіях. Є також докази проти того, що GM-CSF спричиняє клональну пpоліферацію бластних клітин при цих порушеннях. Хоча було відмічено збільшення кількості бластних клітин, особливо у пацієнтів з резистентною анемією з надлишком бластних клітин. У деяких пацієнтів спостерігались інші покращення у вигляді можливості повної відмови від переливання крові. Не було стабільного підвищення рівня тромбоцитів у крові. Коли препарат відміняють, показники крові повертаються до початкового рівня [цит. по 10]. Тому застосування GM-CSF найкориснішим є у тих випадках, коли метою є вберегти пацієнта від інфекції.
При апластичній анемії легкої чи помірної форми спостерігається збільшення кількості нейтрофілів, еозинофілів та моноцитів. При складніших формах жодних зрушень не відбувається. Було помічено, що при апластичній анемії GM-CSF збільшує кількість лімфоцитів та їх активність. Potter спостерігав вагоме збільшення кількості нейтрофілів у пацієнтів із важкою формою апластичної анемії, використовуючи комбінацію GM-CSF та антилімфоцитарного глобуліну (АЛГ). Ці пацієнти мали змогу відмовитися від переливання тромбоцитів, хоча їм все ще потрібно було проводити переливання еритроцитарної маси. Вважалося, що початкова швидка відповідь у цих пацієнтів виникала завдяки GM-CSF, з подальшим перебуванням під впливом АЛГ [22] . Тому правильно буде вважати, що GM-CSF має короткочасний ефект, і найкращим його використанням для пацієнтів з нейтропенією є використання для запобігання інфекційних ускладнень.
Можливим є застосування GM-CSF при різних формах гострої мієлобластної лейкемії, де його роль полягає у спонуканні лейкемічних клітин вступати до клітинного циклу, що робить їх чутливими до дії різноманітних цитостатичних препаратів, таких як цитозину арабінозид. Хоча і в цьому випадку дані, отримані різними вченими є досить суперечливими. Поясненням цього, швидше за все є те, що всі вони використовували GM-CSF паралельно з іншими препаратами.
Було помічено, що призначення GM-CSF збільшує циркуляцію гемопоетичних клітин-попередників у периферійній крові. Ці клітини в змозі відновити гемопоез після великої дози хімотерапії. Shea вживав високі дози карбоплатину для пацієнтів з різноманітними солідними пухлинами і потім призначав або GM-CSF окремо, або GM-CSF з підтримкою ПCК. ПCК забиралися після стимуляції GM-CSF. Було відмічено незначне зменшення часу, потрібного на відновлення нейтрофілів, та значне покращення у відновленні тромбоцитів і зниження показів до переливання тромбоцитів [23].
Під час лікування високими дозами хіміотерапії з аутогенною трансплантацією кісткового мозку (АТКМ) для лікування лімфоїдних пухлин, післятрансплантаційне введення GM-CSF спричиняє зменшення періоду нейтропенії з явним зменшенням кількості днів, коли у пацієнта спостерігається лихоманка, та часу перебування в лікарні. Уцілому зменшення тривалості нейтропенії у нормі становило 2-3 дні, і подальше зменшення було б іще більшим успіхом [цит. по 10].
Коли АТКМ проводиться в комбінації з введенням ПCК, стимульованими GM-CSF, приживлення відбувається швидше і також значно підвищується відновлення тромбоцитів. Bennett, використовуючи GM-CSF для пацієнтів, які отримують високі дози хіміотерапії і відновлення кровотворення за допомогою АТКМ і/або ПCК, відзначив пряму вигоду для пацієнтів від використання GM-CSF у вигляді деякого зменшення кількості днів перебування у лікарні, використання антибіотиків та використання інших агресивних тестів та процедур. Вони також підрахували виграш у витратах при використанні GM-CSF, хоча не відомо, чи було включено ціну самого GM-CSF [7]. Link виявив, що GM-CSF вкорочує час відновлення нейтрофілів, зменшує ймовірність бактеріальної інфекцїї і зменшує час ізоляції для пацієнтів, яким зроблено АТКМ для лікування гострої лімфобластної лімфоми чи не ходжкінські лімфоми [18].
Метою стимуляції СКПК є добути з периферійної крові стільки клітин-попередників, скільки можливо, проте нормальні умови для досягнення цього поки що не визначені. Важливим є те, що пацієнти повинні пройти мінімальний курс лікування і мати добрі резерви кісткового мозку. У деяких з цих досліджень використовували циклофосфамід, який також відомий як стимулятор мобілізації ПCК, і має відносно м’якший цитотоксичний ефект на стовбурові клітини, ніж GM-CSF. У таких умовах вихід ПCК набагато більший, і виздоровлення від цитопенії, спричиненої циклофосфамідом, відбувається раніше.
Алогенна трансплантація кісткового мозку є іншою галуззю, де досліджувався вплив GM-CSF. У подвійному рандомізованому сліпому експерименті призначався рекомбінантний GM-CSF людини або плацебо пацієнтам, яким проводилась алогенна трансплантація кісткового мозку для лікування лейкемій. Деякі з них хворіли на мієлобластну лейкемію. Було помічено, що середня кількість нейтрофілів на 14 день була набагато вищою у групи, яка отримувала препарат, ніж у групи, яка отримувала плацебо (1.9х109/літр проти 0.46х109/літр), проте час, протягом якого кількість нейтрофілів відновлювалась до рівня >0.5x109, значно не вкорочувався. Це може бути завдяки його низькій ефективності та малій кількості пацієнтів. Не було посилення проявів симптому “трансплантант проти господаря”, хоча у групи, що отримувала GM-CSF спостерігався підвищений рівень лімфоцитів між 10 та 15 добою. Важливим було те, що не було випадків того, що лікування збільшує ризик лейкемічних рецедивів, не зважаючи на те, що найдовший період спостереження при цьому був 18 місяців. Виживання серед пацієнтів обох груп було однаковим, проте в подальшому лише 30% процентів доживали до 5 місяців (з обох груп), що досить важко піддаєтья поясненню [18].
При іншому спостереженні використовували GM-CSF при трансплантації кісткового мозку, вільного від Т-лімфоцитів, пацієнтам, частина з яких хворіла на мієлоїдну лейкемію. Завдяки препарату було вкорочено час, необхідний для відновлення нейтрофілів, а також знижено смертність від інфекцій та інші посттрансплантаційні ускладнення, хоча це не стало закономірністю. Випадки бронхопневмонії та обсяги використання антибіотиків зменшились у групі, що отримувала GM-CSF [11].
Потенційно важливими є спостереження того, що GM-CSF можна використовувати для покращення стану хворих, яким було невдало зроблено алогенну трансплантацію кісткового мозку. Раніше єдиною надією для таких пацієнтів була повторна трансплантація, як правило з невтішними результатами. Можливо, в майбутньому GM-CSF займе належне місце в лікуванні таких пацієнтів.
Хворі з вірусом імунодифіциту людини (ВІЛ), поряд із багатьма проблемами, що стосуються дисфункції Т-лімфоцитів, мають ряд інших гематологічних негараздів, частина з яких може бути ятрогенними. Різноманітні цитопенії можуть виникати завдяки ВІЛ-спричиненій інфекції самі по собі. Це може бути підсилене деякими ліками, такими як зидовудин. Іншими проблемами цих пацієнтів є ретиніт, спричинений вірусом цитомегалії, що часто призводить до сліпоти. Лікування цих станів вимагає використання антивірусного агента ганцикловіру, що в свою чергу може призвести до мієлосупресії. Пацієнтам, в яких вже кількість клітин крові знижена, доза ганцикловіру повинна бути зменшена з відповідною втратою ефективності [цит. по 10]. Досить важливо є знайти засоби подолання цієї проблеми.
У першій частині досліджень GM-CSF, що вводили хворим на СНІД, спричиняв збільшення кількості периферійних нейтрофілів та еозинофілів, а також помірне підвищення рівня моноцитів. Покращувалась також функція нейтрофілів. У плазмі спостерігалось збільшення рівня ВІЛ р-24 антигену, який знову знижувався під час наступних циклів лікування. Гематологічна токсичність GM-CSF виявилася нижчою, ніж терапія з використанням зидовудину. Було відзначено роль GM-CSF у лікуванні нейтропенії, індукованої ганцикловіром [17].
На теперішній час існує 4 рекомбінантних мієлоїдних фактори росту-2 гранулоцитарно-макрофагальних (сарграмостим і малграмостим) і 2 гранулоцитарних (філграстим і ленограстим). Для отримання сарграмостима використовували клітини дріжджів, малграмостима і філграстима – клітини E.coli, ленограстима – клітини яєчника китайського хом’ячка.
2.3. Граноцит як рекомбінантна форма гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Усі природні фактори росту є глікопротеїнами. З трьох зареєстрованих і дозволених для використання в Європі мієлоїдних факторів росту, GM-CSF (лейкомакс) і G-CSF (нейпоген) – не глікозильовані, оскільки їх молекула в процесі рекомбінантного отримання втратила цукор; G-CSF (граноцит) – глікозильований, тобто, подібно до природних факторів росту, є глікопротеїном.
Граноцит складається із 174 амінокислотних залишків, що утворюють один поліпептидний ланцюг, у 133-й позиції якого, так як і у природного G-CSF, до триптофану приєднано цукор. Молекулярна маса граноцита біля 20кДа. Показано, що по структурі і активності граноцит ідентичний натуральному G-CSF людини.
Доведено високу ефективність граноцита при нейтропенії: було показано, що у хворих із солідними пухлинами після хіміотерапії медіана тривалості нейтропенії з кількістю лейкоцитів < 1.0x109/літр у групі, що отримувала плацебо складає від 8.5 до 9.5 дні, у той час, як у хворих, що отримували граноцит, період лейкопенії коротший – всього 2 чи 3 дні, в залежності від дози препарату [цит. по 2].
Порівняння ефективності граноцита і GM-CSF у боротьбі з нейтропенією у хворих, що отримали високі дози циклофосфана, показало швидше відновлення показників гранулоцитопоеза при використанні граноцита.
У великому рандомізованому дослідженні, що включало 120 хворих на рак молочної залози, які отримували інтенсивну хіміотерапію, продемонстровано, що число бактеріологічно доведених інфекцій у групі хворих, які отримували граноцит, склало 8%, а в контрольній групі – 22% [цит. по 2].
Швидкість відновлення кількості нейтрофілів корелює з періодом перебування хворих у стаціонарі. По даним H.Link, у групі хворих, які отримали граноцит, кількість нейтрофілів до 28-го дня після трансплантації кісткового мозку перевищила 1.0х109/літр у 88%; а середній час перебування в стаціонарі склав 25 днів; у групі, що отримала плацебо, кількість гранулоцитів відновилась до 28-го дня лише у 44% хворих, середній час перебування в стаціонарі склав 36 днів [18].
Для боротьби з цитостатичною нейтропенією граноцит починають застосовувати через 44 – 48 годин після закінчення курсу хіміотерапії і продовжують до тих пір, поки кількість лейкоцитів складатиме не менше 1.0х109/літр, що повинно бути зафіксовано трьома послідовними аналізами. Таке лікування у більшості хворих не запобігає розвитку лейкопенії, але скорочує її тривалість; звичайно необхідність призначення граноцита зберігається протягом 8 – 10 днів. У деяких пацієнтів кількість лейкоцитів збільшується дуже швидко, досягаючи 10 – 15х109/літр і більше протягом кількох днів, однак відміна препарату призводить у цих випадках до швидкої нормалізації кількості лейкоцитів. При високодозовій хіміотерапії і трансплантації кісткового мозку тривалість лікування граноцитом складає 14 - 25 днів. У ряді випадків після відміни граноцита настає перехідна лейкопенія, що не супроводжується розвитком інфекційних ускладнень [цит. по 2].
Призначення граноцита одночасно з хіміотерапією не запобігає нейтропенії, а може навіть поглибити її. Це пов’язано з тим, що велика кількість гранулоцитарних попередників, що вступають під впливом G-CSF у проліферативний цикл, опиняються під впливом хіміотерапії.
2.4. Еритропоетин. Еритропоетин (EPO) застосовувався при лікуванні термінальної стадії ниркової недостатньості при діалізі з наслідками у вигляді збільшення рівня гемоглобіну, зменшення симптомів анемії та зниженні показів до переливання крові. EPO може відігравати важливу роль у лікуванні цих паціентів, якщо в них низький рівень власного EPO.
Не зовсім зрозуміла ситуація у інших випадках, коли рівень ендогенного EPO нормальний або підвищений. Проводилися дослідження з пацієнтами, в яких були різні форми мієлом та інші типи злоякісних новоутворень кісткового мозку. Не зважаючи на високі рівні циркулюючого ендогенного EPO та низькі резерви кісткового мозку, було показано, що еритропоез може бути підсилений введенням додaткового екзогенного EPO. Це призводить до зменшення кількості симптомів хвороби та зменшення вимог до переливання крові. Ці покращення були, як правило, незначні, і частими були випадки виникнення тромбозів [20]. Не схоже на те, що EPO знайде собі застосування в лікуванні таких паціентів.
Інші хвороби, при яких застосовували EPO, включали ВІЛ інфекції. Було відмічено відступ анемії, спричиненої терапією з використанням зидовудину із зниженням вимог до переливання крові. Зафіксовано також покращення стану пацієнтів із ревматоїдними артритами та хронічною анемією.
Потенційною можливістю застосування EPO в майбутньому є використання його при зборі крові у пацієнтів перед операцією. Специфічні релігійні організації, такі як Свідки Єгова, під впливом певних обставин не заперечують проти лікування з використанням EPO. Riggs застосовував введення EPO членам цієї секти, які мали анемію, перед операціями на серці з добрими результатами. Застосовувалось також використання EPO для лікування хворих, у яких була підвищенна кількість антитіл проти власних еритроцитів та анемія хронічної форми, що вимагала хірургічного втручання. Кількість еритроцитів збільшилась завдяки введенню EPO, незалежно від переливання еритроцитної маси. Інші стани, що спричиняють хронічну анемію, такі як серповидноклітинна анемія, можуть також бути ймовірними кандидатами до застосування EPO. Терапія з використанням EPO добре переноситься [цит. по 2].
Важливим є те, що рекомбінантний EPO дуже схожий на той, що виробляється клітинами ссавців, тому їх важко розрізнити. Тому можливим є його незаконне використання, наприклад атлетами, щоб збільшити кількість еритроцитів та їх здатність переносити кисень. Це може призвести також до збільшення в’зкості крові, що є досить небезпечним.
2.5. Інші ростові фактори. Макрофагальний колонієстимулюючий фактор (M-CSF) є відносно специфічним моноцитарно-макрофагальним ростовим фактором, виділеним із сечі людини. Рекомбінантний M-CSF вперше було отримано в клітинах мавпи Kawasaky. Обидва вони мають ідентичні властивості. M-CSF стимулює диференціацію клітин кісткового мозку в моноцитарно-макрофагальні колонії, а також підвищує продукцію моноцитами інтерферону та протипухлинного фактору [17].
Однією досить цікавою областю застосування M-CSF є боротьба з грибковими інфекціями. У більшості хворих спостерігалося послаблення або повне зникнення інфекції, включаючи двох, у яких був резистентний печінковий кандидоз, що було доведено за допомогою біопсії [8]. У тих пацієнтів, які отримували M-CSF після трансплантації кісткового мозку, не було загострення синдрому “трансплантант проти господаря”. M-CSF можна використоувати для полегшення стану пацієнтів із пригніченою функцією імунної системи, а також тих, у кого прогресує грибкова інфекція.
Є повідомлення про успішне подвійне сліпе рандомізоване дослідження із застосуванням M-CSF при аутогенній та ізогенній трансплантації кісткового мозку у хворих на лейкемію. Рівень гранулоцитів у крові нормалізувався раніше у групи, що отримувала M-CSF, хоча і повернувся до початкової позначки через 2–3 дні. Не було загострення синдрому “трансплантант проти господаря” та лейкемічних рецидивів [цит. по 10].
Інтерлейкін-2 (IL-2) є сильнодіючим фактором росту Т-лімфоцитів, що синтезується антиген-специфічними Т-клітинами і взаємодіє із специфічним IL-2R або ТАС-антигеновим рецептором. Можливо існує ще один рецептор з молекулярною масою 75кДа, що забезпечує взємодію M-CSF із клітиною. Результати перших дослідів показали, що у меншої частини пацієнтів спостерігався регрес пухлини, коли використовували сам M-CSF, чи комбінацію його з лімфоцитами, активованими in vitro за допомогою IL-2 (лімфокін активовані кіллери або LAK клітини). Було відмічено сильну їх токсичність, що часто загрожувала життю, пов’язану із виникненням крихкості капілярів при високих дозах, гіпотонією та легеневими набряками. Лише у незначної частини пацієнтів спостерігалася часткова ремісія. Використання IL-2 у нижчих дозах та з іншими режимами призначення може зменшити токсичність [8].
IL-2 використовувався у клінічних дослідженнях для індукції LAK клітин. IL-2 разом із LAK клітинами або самостійно використовувався переважно при карціномах нирок та злоякісних меланомах. Позитивні результати становили 20-30%, більшість з яких були частковими, що свідчить про низьку доцільність клінічного використання препарату, зважаючи на те, що препарат сам по собі є токсичним [8].
Іншим цікавим підходом до використання IL-2 є активація аутогенних лімфоцитів, відфільтрованих від ракових клітин (TIL), як форма адаптивної клітинної імунотерапії. Описано визначну антипухлинну активність застосування TIL із IL-2 проти клітин карціноми нирок in vitro.
Інші можливості використання включають застосування IL-2 в комбінації з іншими біологічно активними речовинами, такими як інтерферон, IL-4 і IL, для отримання користі з можливості цих агентів активувати рецептори до IL-2. Моноклональні антитіла проти пухлин також можуть підсилювати антипухлинну активність IL-2. Можливо також те, що IL-2 може використовуватись для підсилення ефекту “трансплантант проти лейкемії”, що спостерігалося при алогенній трансплантації кісткового мозку.
Недавно було описано властивості ще одного фактора росту – інтерлейкіну-1(IL-1). Перша частина досліджень показала побічні ефекти, що виникають під час його застосування: підвищення температури, відчуття холоду, головна біль, гіпертонія, тошнота, блювання, біль у м’язах та суглобах. Можливо його потрібно використовувати в комбінації з GM-CSF або у IL-2/LAK комбінації. Інші можливості включають використання антагоністів до IL-1 рецепторів, що в дослідах на тваринах продемонструвало захист від інфекцій та зниження проліферації мієлоїдних лейкемічних клітин in vitro [12].
Інтерлейкін-3 (IL-3, Multi-CSF, CSF-2a, CSF-2b, hematopoetin 2) є мультипотенційним ростовим фактором, чиї властивості частково співпадають із GM-CSF, хоча IL-3 краще діє на менш зрілі клітини-попередники. Доклінічні дослідження на тваринах показали, що IL-3 у комбінації з GM-CSF, може підвищувати рівень СКПК у периферійній крові та покращувати приживлення кісткового мозку після трансплантації. Alter відкрив, що застосування IL-3 in vivo прискорює відновлення ПCК і збільшує розмір та кількість колоній стовбурових клітин кісткового мозку. IL-3 використовували у комбінації з GM-CSF [5]. У частині другій досліджень Dunbar призначав спочатку GM-CSF, а потім IL-3, з перервою у 8 тижнів пацієнтам із мієлодисплазією. Було помічено, що IL-3 мав схожу з GM-CSF активність щодо термінів збільшення рівня нейтрофілів і не мав впливу на зниження кількості тромбоцитів (на відміну від GM-CSF). Ті ж учені використовували IL-3 для покращення стану пацієнтів із іншою формою анемії в одночасній комбінації з GM-CSF. Обидва фактори покращували еритропоез, хоча IL-3 відводилася головніша роль. Токсичність IL-3 зумовлювала виникнення у пацієнтів нудоти, втоми, що не зникали при зниженні дози препарату. Було порівняно ефект застосування комбінації IL-3 та GM-CSF та застосування чистого IL-3 у пацієнтів із різноманітними пухлинами. Комбінація була ефективнішою щодо стимуляції гемопоезу і дозволяла вкоротити тривалість лікування завдяки позитивному впливу IL-3 на тромбопоез [15].
При лікуванні хворих із мієлодиспластним синдромом та апластичною анемією відзначалась різноманітність отриманих результатів. У багатьох пацієнтів було досягнуто підвищення рівня лейкоцитів та тромбоцитів. Токсичність була незначною, загальний рівень гістаміну в крові не піднявся [цит. по 10].
IL-3 використовувався для лікування пацієнтів із мієлодиспластним синдромом і призводив до підвищення утворення клітин крові всіх ліній, хоча вплив на еритропоез був дещо нижчий. Двоє з чотирьох хворих із важкою формою тромбоцитопенії покращило свій стан до рівня, коли вже можна відміняти переливання тромбоцитарної маси. Побічні ефекти були мінімальними [8].
Іншим можливим простором для застосування IL-3 могло б бути відновлення кісткового мозку після хіміотерапії, хоча зараз немає достатньо інформації стосовно цього. Існує думка, що IL-3 може стимулювати клональний ріст злоякісних новоутворень, таких як рак легень [8].
Інтерлейкін-4 (IL-4) вже пройшов кілька стадій досліджень. Є цікаві доклінічні дані, які свідчать про те, що він має антиракові властивості або відіграє роль у довготривалій антипухлинній резистентності. Було показано роль рекомбінантного IL-4 людини у вигляді позитивного впливу на перебіг захворювання у пацієнтів із резистентною формою хвороби Ходжкіна після провалу високодозової хіміотерапії та аутотрансплантації кісткового мозку. Переважаючими побічними ефектами було виникнення гарячки, головні болі, затримка рідини в організмі та підвищення рівня лужної фосфатази. Розробляється метод застосування комбінації IL-4 та IL-2 з використанням TIL. Експерименти іn vivo з використанням лімфоцитів пацієнтів, які отримали IL-2, показали, що IL-4 може підсилювати індуковану IL-2 або антитілами проліферацію лімфоцитів. З цього можна зробити висновок про можливу роль IL-4 у збільшенні проліферації TIL та продукції LAK ex vivo [8]. Іншим ситуаціями, при яких можливе застосування препарату є атопія, аутоімунні реакції та запальні процеси.
Інтерлейкін-6 (IL-6) є сильнодіючим цитокініном, що регулює гемопоез та імунні реакції організму. Спочатку він називався 2-інтерферон, стимулюючий фактор-2 В-лімфоцитів і т.п. Вже проведено дослідження його властивостей in vitro, але клінічних досліджень іще не було. Викликає цікавість можливість його застосування при різноманітних новоутвореннях, таких як мієлома.
Фактор стовбурових клітин (SCF) є малоописаним ростовим фактором, дія якого спрямована на посилення проліферації ранніх попередників гемопоетичних клітин, особливо за присутності факторів росу, таких як IL-6, IL-3 і G-CSF [8].
Інтерлейкін-9 (IL-9) було виділено із лінії Т-клітин гризунів родини Muridae. Пізніше було встановлено, що ген, який його кодує, знаходиться у людини на 5-й хромосомі. IL-9 сприяє формуванню еритроїдних колоній. IL-9 людини було виділено з мегакаріобластних лейкемічних клітин. Він може пригнічувати розвиток деяких злоякісних новоутворень кровотворної тканини. Можливо, що після подальших досліджень ролі IL-9 в цих процесах, виникне можливість його застосування при трансплантаціях кісткового мозку та терапії раку [13].
Інтерлейкін-11 (IL-11) було виділено з кісткового мозку приматів. У комбінації з IL-6 він може підтримувати відновлення мегакаріоцитів після хіміотерапії та стримувати розвиток деяких пухлин [12].
Висновки
Ростові фактори є великою групою гормонів, що діють на всі лінії гемотопоетичних клітин. Наявність на клітинах-попередниках рецепторів до якогось певного типу ростових факторів дає змогу використовувати їх для збільшення кількості клітин крові якоїсь окремої лінії. Дослідження гемопетичних ростових факторів вносить нове у розуміння механізмів гемопоезу. Багато їх властивостей забезпечують їм широке застосування при різних клінічних ситуаціях.
EPO і G-CSF знайшли собі місце при лікуванні різноманітних захворювань. Основною сферою їх використання є збільшення ефективності протиракової терапії, де вони відіграють значну роль. Роль GM-CSF ще до кінця не зрозуміла; висока токсичність робить його менш привабливим засобом лікування нейтропеній та нейтропенійних сепсисів, проте його біологічна активність забезпечує йому інші потенційно можливі сфери застосування, наприклад для виведення клітин-попередників із кісткового мозку до периферичної крові. Застосування комбінацій ростових факторів відіграє величезну роль у лікуванні цитопеній (особливо нейтропеній), спричинених хіміотерапією. Перспективним є відновлення гемопоезу та боротьба із злоякісними новоутвореннями з використанням комбінацій різних інтерлейкінів та GM-CSF. Ростові фактори також можна застосовувати при різних хворобах, що не пов’язані з виникненням пухлин. Очікується збільшення їх ролі в лікуванні СНІДу. Як тільки відкриються нові особливості біології цитокінінів та ростових факторів, відбудеться подальше розширення їх застосування.
Список використаної літератури.
1.Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж.// Молекулярная биология клетки: Пер. с англ.– М.: Мир, 1994.– с.176-186.
2.Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и его клиническое использование// Терапевтический архив.– 1998.– № 4. С.80-84.
3.Дэвид Г., Натан. Регуляция кроветворения// Гематология и трансфузиология.–1994.– 39, № 2.– С.56-60.
4.Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я.// Клеточные основы кроветворения: – М.: ”Медицина”,1977.
5.Alter R, Welniak LA, Jackson JD et al., In-vitro clonogenic monitoring of peripheral blood stem cell collection following interleukin-3 administration// Blood .– 1990.–76 (suupplement 1).– P. 129a.
6.Antman KS, Griffin JD, Elias A et al., Effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on chemotherapy-indused myelosuppression// New England Journal of Medicine.– 1988.– № 319.– P. 593-598.
7.Bennett CL, Greenberg P, Gulati SC, Advani R & Bonnem E. GM-CSF decreases duration of cytopenia and hospitalization, and in-hospital costs in patients with Hodgkin’s disease treated with high-dose chemotherapy and autologous bone marrow transfusion (ABMT)// Blood.– 1990.–76 (supplement 1).– P. 132a.
8.Borden EC & Sondel PM. Lymphokines and cytokines as cancer treatment// Cancer.– 1990.– 65.– P. 800-814.
9.Crawford J, Ozer H, Stoller R et al. Reduction by granulocyte colony-stimulating factor of fever and neutropenia-indused by chemotherapy in patients with small-cell lung cancer// New England Journal of Medicine.–1991.– № 325.– P. 164-170.
10.Davis I, Morstyn G. Clinical uses of growth factors// Bailliere’s Clinical Haematology.– 1992.– 5, № 3.– P. 353-377.
11.De Witte T, Gratwohl A, Van Der Lely N et al. A multicentre double blind randomized trial of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in recipients of allogeneic T-cell depleted bone marrow// Blood .– 1990.–76 (supplement 1).– P. 139.
12.Dinarello CA. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism// Blood.– 1991.– 77.– P. 1627-1652.
13.Donahue RE, Wang EA, Stone DK et al. Stimulation of hematopoiesis in primates by continuous infusion of human GM-CSF// Nature.– 1986.– № 321.– P. 872-875.
14.Douer D, Sagi O, Shaced N, Witz IP & Ramot B. Response to recombinant murine GM-CSF in melphalan treated mice// Blood.– 1987.– 70 (supplement 1).– P. 133.
15.Dunbar CE, Smith D, Kimball J et al. Sequential treatment with recombinant human growth factors to compare activity of GM-CSF and IL3 in the treatment of primary myelodysplasia// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 141.
16.Dunbar CE, Smith D, Kimball J et al. Hematopoietic growth factor treatment of Diamond-Blackfan anemia// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 143.
17.Kawasaki ES, Ladner MB, Wang AM et al. Molecular cloning of a complementary DNA encoding human macrophage-specific colony-stimulating factor// Science.–1985.– 230.– P. 291-296.
18.Link H, Boogaerst M, Carella A et al. Recombinant human GM-CSF after autologous bone marrow transplantation for acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin’s lymphoma: a randomized double blind multicenter trial in Europe// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 152.
19.Mayer P, Lam C, Obenaus H et al. Recombinant human GM-CSF induses leukocytosis and activates peripheral blood polymorphonuclear neutrophils in nonhuman primates// Blood.– 1987.– 70.– P. 206-213.
20.Miller CB, Platanias LC, Ratain MG et al. A phase I/II trial of erythropoietin in the treatment of chemotherapy-indused anemia// Blood.– 1990.–76 (supplement 1).– P. 156.
21.Ohno R, Tomonaga M, Kobayashi T et al. Effect of G-CSF after intensive induction therapy in relapsed of refractory acute leukemia// New England Journal of Medicine.– 1990.– 323.– P. 871-877.
22.Potter MN, Mott MG, Oakhill A. The successful tratment of a case of very severe aplastic anemia with GM-CSF and antilymphocyte globulin// British Journal of Haematology.– 1990.–75.– P. 618-619.
23.Shea TC, Mason JR, Storniolo Am et al. Beneficial effect from sequential harvesting and reinfusing of peripheral blood stem cells in conjunction with rHU GM-CSF and high dose carboplatin// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).–P. 165.
24. Welte K, Bonilla MA, Gillio AP et al. Recombinant human G-CSF: effects on hematopoiesis in normal and cyclophosphamide-treated primates// Journal of Experimental Medicine.–1987.–165.– P. 941-948.
25.Welte K, Zeidler C, Pietsch T et al. Correction of neutropenia in children with glycogenosis Ib by treatment with rhG-CSF// Blood.–76 (supplement 1).– P. 171.
Стобурові клітини
1.1. Стовбурові клітини. Кров містить багато типів клітин, що виконують зовсім різні функції: від транспорту кисню до вироблення антитіл. Деякі з цих клітин функціонують виключно в межах кровоносної системи, а інші використовують її лише для транспорту, а свої функції виконують в інших місцях. Однак життєвий цикл всіх клітин крові деякою мірою схожий. У всіх них час існування обмежений, і вони безперервно утворюються протягом усього життя людини. І, наприкінці, суттєвим є те, що всі вони походять від одного того ж типу стовбурових клітин кісткового мозку. Таким чином, ця гемопоетична, або кровотворна, стовбурова клітина плюрипотентна, оскільки дає початок усім видам термінально диференційованих клітин крові [1].
Клітини крові можна розділити на червоні і білі – еритроцити і лейкоцити. Еритроцити залишаються в межах кровоносних судин і переносять О2, зв’язаний з гемоглобіном. Лейкоцити борються з інфекцією, а також поглинають і перетравлюють залишки зруйнованих клітин і т.п., виходячи для цього через стінки капілярів в тканини. Крім цього, в крові у великих кількостях містяться тромбоцити, що являють собою не звичайні цілі клітини, а дрібні клітинні фрагменти, або “міні-клітини”, що відокремилися від кортикальної цитоплазми великих клітин, що називаються мегакаріоцитами. Тромбоцити специфічно прилипають до ендотеліальної вистилки уражених кровоносних судин, де допомагають у відновленні їх стінки і беруть участь у процесі згортання крові. Різні типи клітин крові і їх функції наведено в табл.1.
В той час як кожен еритроцит схожий на всякий інший еритроцит, а тромбоцит на інший тромбоцит, лейкоцити поділяються на ряд різних класів, На основі морфологічних особливостей, які видно в світловий мікроскоп, їх традиційно поділяють на три головні групи: гранулоцити, моноцити і лімфоцити. Всі гранулоцити містять численні лізосоми і секреторні гранули, і отримали свої назви за відмінний характер забарвлення цих гранул. Різниця в забарвленні відображує важливі хімічні і функціональні особливості. Нейтрофіли (які називать також поліморфноядерними лейкоцитами через багатодільні ядра) найчисленніші з гранулоцитів, захоплюють, вбивають і перетравлюють мікроскопічні організми, особливо бактерії. Базофіли виділяють гістамін (а у деялих видів серотонін), який бере участь у запальних реакціях. Еозинофіли допомагають у руйнуванні паразитів і впливають на алергічні реакції.
Моноцити, виходячи з кров’яного русла, стають макрофагами, які поряд з нейтрофілами є головними “професіональними фагоцитами”. Обидва типа фагоцитів містять спеціалізовані органели, які зливаються з новоутвореними фагоцитозними гранулами (фагосомами) і атакують поглинуті мікроорганізми за допомогою високореактивних молекул супероксида (О2) і гіпохлорита (НОСІ), а також концентрованої суміші лізосомних гідролаз. Макрофаги, однак, значно більші за розмірами і довше живуть, ніж нейтрофіли, а до того ж мають унікальну особливість перетравлювати великі мікроорганізми, такі як найпростіші.
Табл. 1*
Тип клітин | Головні функції | Нормальний вміст в крові людини (в 1 л)
Еритроцити | Транспортують О2 і СО2 | 5 х 1012
Лейкоцити 1.Гранулоцити
а)нейтрофіли
(поліморфноядерні лейкоцити)
б)еозинофіли
в)базофіли
2.Моноцити
3.Лімфоцити
а)В-клітини
б)Т-клітини
4.Клітини-кіллери
(NK-клітини) |
Фагоцитують і руйнують бактерії
Руйнують більші паразитичні організми і впливають на алергічні запальні реакції
Виділяють гістамін і серотонін при деяких імунних реакціях
Стають макрофагами в тканинах, де фагоцитують і переварюють бактерії, інорідні тіла і старіючі клітини
Виробляють антитіла
Вбивають клітини, інфіковані вірусом, і регулюють активність інших лейкоцитів
Вбивають клітини, інфіковані вірусом, і клітини деяких пухлин
|
5 х 109
2 х 10 8
4 х 107
4 х 108
2 х 109
1 х 109
1 х 108
Тромбоцити | Ініціюють згортання крові | 3 х 1011
* Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В 3-х томах. Т.3. – М.: Мир, 1994. С.179.
Лімфоцити беруть участь у імунній відповіді і представлені двома головними класами: В-лімфоцити виробляють антитіла, а Т-лімфоцити вбивають клітини, інфіковані вірусом, і регулюють активність інших лейкоцитів. Крім того, існують лімфоцитоподібні клітини, що називаються природними кіллерами, які здатні вбивати деякі види пухлинних та інфікованих вірусом клітин.
Утворення клітин крові (гемопоез) піддається складному контролю, при якому кількість клітин кожного типу регулюється індивідуально, відповідно до зміни потреб організму.
На вершині ієрархії кліти-попередників знаходиться клітина, що дуже рідко зустрічається – плюрипотентна стовбурова клітина. Ця клітина внаслідок сохастичного процесу самооновлюється або диференціюється в одному з трьох напрямків: в мієлоїдну стовбурову клітину, в клітину-попередник, якій судилося стати В-клітиною в кістковому мозку, або в клітину, яка зазнає Т-клітинного диференціювання в тимусі. Мієлоїдні стовбурові клітини можуть в подальшому диференціюватися в родоначальників еозинофільного ряду, в клітини, що мають здатність розвиватися у трьох напрямках – по еритроїдному, мегакаріоцитарному або базофільному, або стати родоначальниками фагоцитів. Ці мультипотентні родоначальники в підсумку диференціюються в уніпотентні комітовані клітини. Вони стають клітинами-попередниками, які під дією гемопоетичних ростових факторів, специфічних для конкретних клітинних ліній, перетворюються на морфологічно розрізнені кровотворні клітини.
Різні типи кров’яних клітин і їх найближчих попередників у кістковому мозку можнаі впізнати за зовнішнім виглядом. Вони перемішані один з одним, а також з жировими клітинами і фібробластами, що утворюють ніжну опорну сітку колагенових волокон та інші компоненти позаклітинного матриксу. Крім того, вся тканина пронизана тонкостінними кровоносними судинами (кров’яними синусами), в які переходять новоутворені клітини крові. Є також мегакаріоцити; на відміну від інших кров’яних клітин вони залишаються в кістковому мозку і після дозрівання, складаючи одну з найпомітніших гістологічних особливостей цієї тканини; вони надзвичайно великі (до 60мкм в діаметрі) і мають високополіплоїдне ядро [1,4]. В нормальних умовах мегакаріоцити обліплюють стінки кров’яних синусів і протягують свої відростки через отвори в їх ендотеліальній вистелці; від цих відростків відокремлюються тромбоцити, які потім відносить кров.
1.2. Ростові фактори та механізм їх дії. Кровотворна система знаходиться під контролем ростових факторів, що виробляються не лише у кістковому мозку, а й в усіх тканинах. Вони працюють у тісному зв’язку для забезпечення стабільного гемопоезу і задовільнення неочікуваних вимог у кровотворних клітинах шляхом підвищення їх продукції в одному чи багатьох кровотворних компартментах.
Дотепер відомо вже не менше 20 факторів росту гемопоетичних клітин, з яких найкраще вивчено фактор стовбурових клітин (SCF, C-kit ligand), інтерлейкін 1 (ІL-1), ІL-3, ІL-6, ІL-11, гранулоцито-моноцитарний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), гранулоцитарний колонієстиму-
люючий фактор (G-CSF), моноцитарний колонієстимулюючий фактор (М- CSF), фактор, що стимулює ріст і розвиток еритроїдних попередників – еритропоетин, фактор росту і розвитку мегакаріоцитів, або тромбопоетин. Відомі також інгібітори гемопоезу – макрофагальний протеїн-1 і фактор,що пригнічує гранулопоез – трансформуючий ростовий фактор [цит. по 2].
Рецептори ранніх ростових факторів широко представленні на кровотворних клітинах. Вони були знайдені на плюрипотентних стовбурових клітинах, частково і повністю комітованих клітинах-попередниках. Точне розподілення рецепторів до пізнодіючих ростових факторів невідомe, але вважають, що вони експресуються на комітованих попередниках, а саме: еритропоетиновий рецептор може бути експресований тільки на попередниках, які комітовані до еритроїдного диференціювання. Еритропоетинові рецептори продовжують експресуватися на проеритробластах і базофільних еритробластах. Макрофаги мають рецептори до ІL-3, GM-CSF, але не до G-СSF. Еозинофіли мають рецептори до ІL-5, GM-CSF і ІL-3 [3].
Таке розподілення є важливим для клініки гематологічних і онкологічних захворювань, оскільки моноцити, гранулоцити і еозинофіли активуються тими гемопоетичними ростовими факторами, до яких вони мають рецептори. З цієї причини ростові фактори, такі як GM-CSF, ІL-3, високотоксичні при застосуванні їх у якості терапевтичних препаратів, якщо ретельно не контролювати їх дози [3].
Ростові фактори сьогодні міцно ввійшли в клінічну практику, значно розширивши терапевтичні можливості при цілому ряді захворювань.
За остані 20 років спостерігався значний прогрес у лікуванні багатьох злоякісних новоутворень, проте хіміотерапія має високу токсичність, яка накладає обмеження на інтенсивність дози. Це фактор, що до недавнього часу стримував можливість застосовування високодозової хіміотерапії.У зв’язку з цим, невідворотніми є періоди нейтропенії та тромбоцитопенії, що є небезпечним для пацієнтів, оскільки виникають серйозні, а іноді навіть небезпечні для життя, інфекційні та гемостатичні ускладнення, особливо під час застосування високодозової терапії для лікування раку. У зв’язку з цим, інтерес до можливості стимулювання гранулоцитопоеза особливо великий.
Стимуляторами гранулоцитопоеза є кілька факторів росту. Їх дія на мієлопоез тим інтенсивніша і багатогранніша, чим на обмеженіший пул клітин діє той чи інший фактор. Так, ІL-3, що діє на клітини-попередники мієлопоеза, забезпечує їх проліферацію, в той час, як GM-CSF і G-CSF – не тільки проліферацію, але й дозрівання попередників до зрілих гранулоцитів. При цьому G-CSF, діючи лише на попередників гранулоцитопоеза, збільшує число лейкоцитів у крові значно швидше, ніж GM-CSF, оскільки зменшує час дозрівання від попередників до зрілих гранулоцитів із 7 до 1,5 дня і значно активніше, ніж GM-CSF стимулює вихід зрілих гранулоцитів із гранулоцитарного пула кісткового мозку до периферійної крові. Було показано, що видалення гена GM-CSF у миші призводить до зменшення кількості гранулоцитів у крові тільки на 1/10, а внаслідок видалення гена G-CSF кількість гранулоцитів зменшується на 80% [цит. по 2].
2.Використання факторів росту при хворобах системи крові
2.1. Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор. G-CSF було виявлено при вивчені регуляції гемопоезу в дослідах на мишах у 1983 році. Його дію на гемопоетичні клітини вивчали D.Metcalf і N.Nicola. G-CSF людини було вперше виділено в 1985 році із середовища, в якому культивувались клітини карциноми сечового міхура людини. Ген, що кодує утворення G-CSF розміщений на довгому плечі хромосоми 17, яка зазнає перебудови при ряді гематологічних захворювань [цит. по 2].
При вивченні біологічних властивостей G-CSF виявлено, що він стимулює утворення гранулоцитарних колоній in vitro, синергійно з іншими ростовими факторами (ІL-3, GM-CSF, M-CSF) стимулює утворення мегакаріоцитарних, гранулоцитарно-макрофагальних і змішаних колоній in vitro, збільшує виживання і проліферацію незрілих попередників гемопоетичних клітин, стимулює проліферацію комітованих попередників гранулоцитів, а також промієлоцитів і мієлоцитів, вкорочує час розвитку нейтрофільних гранулоцитів від їх попередників, збільшує число попередників гемопоезу в крові, антитілозалежну цитотоксичність, міграцію лейкоцитів і хемотаксис [цит. по 2].
Таким чином, G-CSF діє не лише на попередників гранулоцитопоеза, забезпечуючи їх проліферацію, диференціювання, дозрівання і вихід зрілих гранулоцитів у периферійну кров, але і на зрілі гранулоцити, зумовлюючи збільшення тривалості їх життя, прискорення і збільшення міграцій гранулоцитів до місця запалення, підвищення їх здатності до хемотаксису по відношенню до бактерій і фагоцитозу.
Продуцентами G-CSF є моноцити, фібробласти і ендотеліальні клітини. G-CSF утворюється головним чином у кістковому мозку, але в пренатальному і ранньому натальному періоді – також в печінці і селезінці.
Дія G-CSF відбувається шляхом його зв’язування із строго специфічними рецепторами, які є на гранулоцитарних клітинах всіх стадій дозрівання, але відсутні на клітинах еритроїдного і мегакаріоцитарного рядів. Рецептори до G-CSF є протеїнами, і складаються з одного поліпептидного ланцюга з молекулярною масою 100-150 кДа, що містить у своєму складі в людини 812 або 759 амінокислотних залишків. Є рецептори помірної і високої аффінності. У фізіологічних умовах дія G-CSF відбувається шляхом зв’язування з високоаффінними рецепторами, при збільшенні рівня G-CSF в крові і тканинах відбувається його зв’язування з рецепторами помірної аффінності. На клітинах гранулоцитарного ряду є від 50 до 500 рецепторів на клітину [цит. по 2].
Дія G-CSF відбувається дуже швидко: протягом кількох хвилин після ін’єкції відбувається спочатку зменшення кількості нейтрофілів у периферійній крові, яке пояснюється посиленням адгезії в судинах, що призводить до виходу гранулоцитів із циркуляції, а потім – швидке збільшення кількості нейтрофілів, і протягом 24 годин спостерігається поява незрілих попередників гранулоцитопоеза в периферійній крові.
Досліди на мишах і мавпах продемонстрували, що G-CSF в змозі індукувати нейтрофілію в нормальних тварин і підвищувати відновлення нейтрофілів після використання 5-флорурацилу або загального опромінення організму. Нормальних рівнів нейтрофілів у мавп було досягнуто у межах 10 днів від початку лікування після застосування доз циклофосфаміду, які індукували аплазію. Коли G-CSF починали вводити перед хіміотерапією, рівень нейтропенії був глибшим, проте відновлення не порушувалось. Це вказує на те, що клітини-попередники спонукаються до вступу в клітинний цикл G-CSF, тому стають чутливими до цитотоксичних препаратів [24].
Досліди з Н3-тимідином проводилися для визначення кінетики гранулопоезу людини та мишей після призначення G-CSF. Було показано, що гранулопоез підвищувався на всіх рівнях, а найбільше на рівні мієлобластів. Також очевидним було прискорення дозрівання і виходу клітин, але не спостерігалося ніяких змін у тривалості циркуляції нейтрофілів у кров’яному руслі [цит. по 10].
Можливим є те, що функції нейтрофілів посилюються у пацієнтів, які отримують G-CSF. У них підвищується здатність до хемотаксису, що також забезпечує захист проти різних патогенних факторів, включаючи бактерії та гриби [7].
Перша частина клінічних досліджень продемонструвала, що G-CSF є ефективним у підвищенні числа нейтрофілів при тривалому внутрішньовенному введенні, короткочасному внутрішньовенному введенні та при введенні під шкіру. Навідміну від GM-CSF, вживання G-CSF не супроводжується побічними ефектами. Трапляються скарги на біль у кістках у 20% пацієнтів, підвищення рівня лактатдегідрогенази та сечовини, а також збільшення селезінки у дітей із хронічною нейтропенією. Ці проблеми, як правило, незначні, а біль у кістках легко знімається парацетамолом. Було зафіксовано лише один випадок гострого дерматозу у пацієнта хворого на лейкемію [цит. по 10].
Поряд із дослідженнями ролі та механізмів впливу G-CSF і GM-CSF, необхідними є вивчення патофізіології нейтропенії та сепсису, спричиненого нейтропенією. Було невідомо чи ці проблеми були спричинені неадекватною кількістю нейтрофілів, чи нейтрофіли цих пацієнтів були якісно недосконалими. Схоже на те, що інфекції в таких пацієнтів спричинені комбінацією цих факторів. Окрім того, у пацієнтів з нейтропенією часто розвивається гарячка без ознак джерел інфекції і мікробіологічних підтверджень інфекції. Без сумнівів, що пацієнти з нейтропенією мають підвищений ризик померти від інфекції, і чим вищі дози хіміотерапії та довші її курси, чи застосування комбінації хіміотерапії та радіотерапії, тим вищий ризик [21].
Проблема нейтропенії, що настає після хіміотерапії ракових захворювань розглядалася багатьма вченими. У багатьох клінічних випадках застосування G-CSF спричиняло значне скорочення тривалості нейтропенії. Було відмічено покращення перенесення пацієнтами інфекцій, зменшення кількості грибкових уражень, скорочення періоду перебування пацієнтів у лікарні і можливість призначення вищих доз хіміотерапії [цит. по 10].
Щоб довести, що зменшення періоду нейтропенії спричинено використанням G-CSF, важливо було провести плацебо контрольовані рандомізовані дослідження. Це було зроблено Crawford et al, використовуючи циклофосфамід і доксорубіцин при терапії раку легень. Ці цитотоксини було вибрано через те що вони широко використовуються для лікування різних форм раку. Рак легенів було обрано як модель раку, що піддається хіміотерапії, і лікування якого ускладнюється інфекціями. Досліджувальні ліки давали при кожному циклі хіміотерапії. Цих пацієнтів пізніше лікували введенням G-CSF. Було відмічено 50% зменшення частоти виникнення гострої нейтропенії у пацієнтів, які отримували G-CSF, внаслідок чого зникала необхідність госпіталізації та використання антибіотиків. Пацієнти, які отримували плацебо, після чого почали отримувати G-CSF, після зникнення нейтропенії були в змозі отримувати повну дозу хіміотерапії з підтримкою G-CSF [9].
При синдромі Костмана введення G-CSF спричиняє збільшення числа нейтрофілів у периферійній крові. При циклічних нейтропеніях тривалість циклу може бути вкорочена, і спостерігається збільшення кількості BFU-E (вибух формуючих одиниць еритроцитів) і GM-CFC (гранулоцит-макрофагальних колонієутворюючих клітин). У пацієнтів із глікогенозом типу Ib G-CSF різко підвищує кількість нейтрофілів з подальшим покращенням перенесення інфекцій. Тривала терапія із застосуванням G-CSF забезпечує захист пацієнтів від інфекцій. Єдиним побічним ефектом була спленомегалія. Це можна вважати рідкісним випадком. Спленомегалія виникає лише у дітей із гострою хронічною нейтропенією. Відзначено також підвищення кількості нейтрофілів і відступ інфекції у цих пацієнтів завдяки G-CSF [25].
Мієлодиспластні синдроми є гетерогенною групою захворювань, деякі з яких характеризуються цитогенетичними порушеннями, зумовлених дефектом довгого плеча 5 хромосоми, де знайдено ген, що кодує GM-CSF. Пацієнти знаходяться у ризику померти від кровотеч, інфекцій чи виникнення гострої лейкемії та анемії. У цьому випадку кількість нейтрофілів може бути збільшена завдяки введенню G-CSF, із збільшенням GM-CFC у кістковому мозку без збільшення клональної проліферації. Цитогенетичні порушення можуть зникнути під час лікування (можливо завдяки селективній стимуляції нормальних клонів гемопоетичних клітин), але знову з'являються після припинення введення G-CSF. При лікуванні 18 пацієнтів за допомогою G-CSF, було відзначено збільшення показників нейтрофілів у 16 з них, проте вони повернулися до початкового стану після припинення терапії. Зменшений ризик інфекції було відмічено коли нейтрофілів було > 1.5x109/літр. Не зважвючи на це, у трьох пацієнтів під час терапії мієлоїдна лейкемія прогресувала. Було відмічено, що G-CSF спричиняє збільшення кількості нейтрофілів у дітей, хворих на апластичну анемію, під час терапії, але ці показники поверталися до початкового рівня після припинення введення G-CSF [цит. по 10].
G-CSF i GM-CSF можуть збільшити кількість нейтрофілів у пацієнтів із мієлодисплазією чи апластичною анемією, але це ще повністю не доведено. Може бути, що G-CSF є більш корисним у лікуванні таких пацієнтів під час гострих інфекційних захворювань. Для хворих на мієлодисплазію ризик стимуляції її трансформації у мієлоїдну лейкемію до кінця не визначено.
G-CSF використовувався для лікування лімфобластної та мієлобластної лейкемії. Знову, було відмічено збільшення кількості нейтрофілів, та зменшення ризику інфекції для обох типів лейкемій. Була тенденція до збільшення швидкості ремісії у групі, яка отримувала G-CSF, але це не стало статистичним показником пізніше. Не було жодної різниці між групами щодо відновлення тромбоцитів, виникненням рецидивів чи кількості днів із гарячкою. Не було відновлення росту мієлобластів у групи, що отримувала G-CSF, що свідчить про те, що його безпечно використовувати в цій групі протягом часу проведення хіміотерапії. Ясно, що немає жодних протипоказів щодо використання G-CSF при гострій лімфобластній лейкемії, і йому випадає головна роль у лікуванні таких пацієнтів [21].
G-CSF використовується при аутотрансплантації кісткового мозку, що проводиться для лікування різних немієлоїдних злоякісних новоутворень. Застосування G-CSF спричиняє значне скорочення періоду нейтропенії, і пряму вигоду для пацієнтів, пов’язану з меншим використанням антибіотиків, зменшенням кількості днів із лихоманкою, періоду парентерального годування та періоду перебування у лікарні.
Важливе місце зараз займає G-CSF при зборі стовбурових клітин периферійної крові (СКПК) для їх трансплантації. Ще декілька років тому було показано, що трансплантація СКПК сприяє швидшому відновленню гемопоезу в порівнянні з трансплантацією кісткового мозку. Здатність G-CSF збільшувати вихід стовбурових клітин у кров розширила можливості інтенсифікації терапії з наступним відновленням гемопоезу за допомогою СКПК. Порівняльні досліди показали, що G-CSF сприяє значно активнішому виходу стовбурових клітин у кров, ніж GM-CSF [цит. по 2].
Для збору СКПК з метою їх наступної трансплантації звичайно використовується доза 10 мкг/кг в день, оскільки при цій дозі досягається найбільший вихід стовбурових клітин у кров. Вводять препарат підшкірно [цит. по 2].
2.2. Гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор. Досліди іn vitro показали, що GM-CSF діє як на дозрілі, так і на недозрілі клітини гранулоцитарно-макрофагального ряду, спричинюючи проліферацію клітин-попередників і диференціацію більш зрілих клітин. GM-CSF може активувати багато функцій фагоцитуючих клітин, включаючи хемотаксис, адгезію, фагоцитоз, втрату грануляції, продукцію супероксидних аніонів, антитілозалежну клітинну цитотоксичність та антипаразитарну активність. У досліді на мишах, GM-CSF, що вводився у черевну порожнину, спричиняв ефект підвищення гранулопоезу з акумуляцією дозрілих нейтрофілів і моноцитів, що спостерігалась у печінці та селезінці. GM-CSF людини, який вводили людиноподібним мавпам, спричиняв помітний лейкоцитоз, що зберігався до 28 днів, який давав (без шкідливих ефектів) збільшення кількості нейтрофілів, еозинофілів, моноцитів і лімфоцитів. Розвивався також незначний ретикулоцитоз. GM-CSF спричиняє однаковий ефект коли його вводять мавпам внутрішньовенозно та підшкірно, проте підшкірний шлях ефективніше викликає лейкоцитоз [13].
GM-CSF є ефективним при введенні нормальним тваринам, а також тваринам, до яких застосовується мієлотоксичне лікування. У мишей, яким давали рекомбінантний GM-CSF шсля мелфалану, спостерігалося вкорочення періоду нейтропенії та зниження загибелі мишей від нейтропенії. Спустошення пулу клітин-попередників гранулоцитів-макрофагів у кістковому мозку і селезінці настає раніше у групи, яка отримує GM-CSF, проте це ще повністю не доведено [14].
Здатність GM-CSF посилювати пpоліферіцію і диференціацію гранулоцитів та макрофагів дає змогу використовувати його в терапії мієлоїдних лейкемій і мієлодиспластних синдромів. Його вплив на функцію нейтрофілів підвищує можливість його використання для збільшення числа нейтрофілів та стимуляції їх функцій у хворих з нейтропенією, а також, можливо, моноцито-мaкрофагальні бактерицидні та протипухлинні властивості. Інші можливі шляхи його використання, що випливають із доклінічних досліджень, базуються на ролі GM-CSF у додатковій терапії інфекційних захворювань, а також його використання у комбінації з іншими цитокінінами для досягнення клінічних відповідей у певних ситуаціях. Наприклад, при апластичних анеміях, пересадках кісткового мозку і для лікування пацієнтів із синдромом набутого імунодифіциту (СНІД) [10].
Ранні дослідження властивостей GM-CSF були утруднені тим, що цей ростовий фактор має видову специфічність. GM-CSF призначався хворим із неоперабельними або метастазними саркомами, у яких був здоровий кістковий мозок. У цих пацієнтів GM-CSF підвищував целюлярність кісткового мозку, спричиняв преферійну нейтрофілію та еозинофілію. Також спостерігалось підвищення кількості клітин-попередників у крові [6].
GM-CSF рідко виявляється в периферійній крові. Проте його було виявлено у хворих із гострими грибковими інфекціями. Схоже на те, що GM-CSF не відповідає за постійний гомеостаз, але може відігравати значну роль у стресових ситуаціях та при запаленнях.
Перша стадія досліджень довела, що результатом введення GM-CSF різними способами є лейкоцитоз, коли переважають нейтрофіли та еозинофіли, а рівень моноцитів підвищений незначно. Підшкірне введення є ефективнішим, ніж внутрішньовенне. На ретикулоцити він не має жодного впливу. Вплив на тромбоцити незначний та мінливий. Мінімум тромбоцитів спостерігається в перші 5 днів лікування у більшості пацієнтів, а максимум досягається в наступні 5 днів [цит. по 10].
Спостерігалася активація моноцитів за допомогою GM-CSF з виявленням ними антипухлинних властивостей in vitro. In vivo було виявлено лише одну часткову відповідь проти солідної пухлини. Це була ліпосаркома, яку до того довго лікували. Пацієнт мав 50% зменшення об’єму пухлини після п’яти циклів GM-CSF. Більше протипухлинних ефектів відмічено не було, хоча вичерпних досліджень у цьому напрямку не проводилось [цит. по 10].
“Ефект першої дози” проявляється при внутрішньовенному введенні GM-CSF. Не пізніше як через 20 хвилин після першої дози у багатьох пацієнтів з’являється рум’янець, біль у спині, посилюється потовиділення, починається тошнота, блювання, невимушені спазми ніг, задишка, розвивається гіпотонія, тахикардія та гіпоксія. Ці реакції з найбільшою частотою зустрічаються у пацієнтів із раком легень та у пацієнтів, яким препарат увели шляхо швидкої внутрішньовенної інфузії. Ці реакції не спостерігалися при продовженні курсу GM-CSF, а виникали лише на початку. Іншими порушеннями, що виникали при високих дозах препарату в першій частині досліджень були тромбози, плевральні та перикардіальні крововиливи, запалення та набряки. При нижчих дозах було відмічено висипи на шкірі, загальна слабкість, в’ялість, втрата апетиту, потіння, біль у м’язах, суглобах, гарячка [цит. по 10].
Порівнюючи результати досліджень, можна дійти висновку, що різні рекомбінантні форми GM-CSF характеризуються різною активністю. Поки що до кінця точно не визначено терапевтичного ефекту препарату. Для цього необхідно провести велике рандомізоване, плацебо контрольоване дослідження, з використанням від чотирьох до шести циклів хіміотерапії.
Перші досліди на людях було проведено в тих ситуаціях, при яких хвороба спричиняла порушення функцій кісткового мозку, наприклад СНІД, мієлодиспластичні синдроми чи після трансплантації кісткового мозку. Завдяки природі цих станів важко бути впевненим, які наслідки виникали завдяки використанню GM-CSF, а які спричиняла сама хвороба. Тим не менше, виявилось, що GM-CSF відіграє певну роль у покращенні нейтрофільних показників при цих станах.
Усі клінічні дослідження, що проводилися з використанням GM-CSF, продемонстрували, що його застосування вкорочує період лейкопенії. Дослідження показали ряд переваг його застосування: скорочувалось застосування антибіотиків, тривалість гарячки, раніше можна було проводити наступний курс хіміотерапії. Наступні дослідження показали зменшення виникнення інфекцій та кількості профілатично перелитих тромбоцитів. Усі ці дослідження становили лише один курс терапії, тому важко екстраполювати результати цілого курсу лікування. Деякі дослідники відмітили збільшення швидкості відновлення тромбоцитів, але це не можна сказати про кожен окремо взятий випадок, і, можливо, немає взагалі жодного впливу на раннє віднoвлення тромбоцитів після застосування GM-CSF.
Нещодавно опубліковано результати подвійного сліпого рандомізованого, плацебо контрольованого дослідження дії GM-CSF у 15 пацієнтів, хворих на рак яєчника, які отримували курси хіміотерапії з карбоплатином та циклофосфамідом. Це було перше дослідження, що оцінило наслідки застосування GM-CSF протягом усього курсу хіміотерапії. Було відзначено, що GM-CSF при всіх дозах збільшує загальну кількість лейкоцитів на 7, 10 та 15 день, у порівнянні з контрольною групою. Кількість нейтрофілів підвищувалась на 7 та 10 день. При найвищій дозі GM-CSF (6 g kg-1 day-1) високий рівень усіх типів лейкоцитів утримувався до 22-го дня. У всіх пацієнтів відмічались позитивні реакції на введення препарату [цит. по 10]. Не можна з упевненістю стверджувати про роль препарату в подаланні інфекції, оскільки було задукоментовано лише один випадок з усієї дослідної групи, до якої входило надто мало пацієнтів, щоб продемонструвати безпечність та переваги призначення GM-CSF при кількох циклах хіміотерапії. Можна спекулювати тим, що отримані вигоди важко продемонструвати, оскільки автор використовував традиційні дози хіміотерапії, що добре переносяться. Вигоди від клінічного застосування GM-CSF не буде остаточно визначено до того часу, поки не буде опубліковано великого рандомізованого дослідження.
У ситуаціях, коли нейтропенія набуває гострої чи хронічної форми, або є вродженою (синдром Костмана), застосування GM-CSF дало змогу збільшити кількість білих клітин крові в більшості пацієнтів. У багатьох хворих переважно підвищується рівень еозинофілів, а не нейтрофілів. Лікування із застосуванням GM-CSF у цих пацієнтів переросло у клінічну вигоду, що пов’язується з подоланням раніше існуючих інфекцій та запобіганням виникнення нових під час хіміотерапії. При синдромі Фелті відмічено роль GM-CSF у індукуванні еозинофілії при незначному збільшенні кількості нейтрофілів, проте не було відмічено ролі препарату в зниженні ризику інфекції у цих пацієнтів [22]. GM-CSF також відіграє роль у лікуванні нейтропенії, спричиненої ліками.
У багатьох дослідженнях вказується роль GM-CSF у підвищенні утворення гранулоцитів при мієлодисплазіях. Є також докази проти того, що GM-CSF спричиняє клональну пpоліферацію бластних клітин при цих порушеннях. Хоча було відмічено збільшення кількості бластних клітин, особливо у пацієнтів з резистентною анемією з надлишком бластних клітин. У деяких пацієнтів спостерігались інші покращення у вигляді можливості повної відмови від переливання крові. Не було стабільного підвищення рівня тромбоцитів у крові. Коли препарат відміняють, показники крові повертаються до початкового рівня [цит. по 10]. Тому застосування GM-CSF найкориснішим є у тих випадках, коли метою є вберегти пацієнта від інфекції.
При апластичній анемії легкої чи помірної форми спостерігається збільшення кількості нейтрофілів, еозинофілів та моноцитів. При складніших формах жодних зрушень не відбувається. Було помічено, що при апластичній анемії GM-CSF збільшує кількість лімфоцитів та їх активність. Potter спостерігав вагоме збільшення кількості нейтрофілів у пацієнтів із важкою формою апластичної анемії, використовуючи комбінацію GM-CSF та антилімфоцитарного глобуліну (АЛГ). Ці пацієнти мали змогу відмовитися від переливання тромбоцитів, хоча їм все ще потрібно було проводити переливання еритроцитарної маси. Вважалося, що початкова швидка відповідь у цих пацієнтів виникала завдяки GM-CSF, з подальшим перебуванням під впливом АЛГ [22] . Тому правильно буде вважати, що GM-CSF має короткочасний ефект, і найкращим його використанням для пацієнтів з нейтропенією є використання для запобігання інфекційних ускладнень.
Можливим є застосування GM-CSF при різних формах гострої мієлобластної лейкемії, де його роль полягає у спонуканні лейкемічних клітин вступати до клітинного циклу, що робить їх чутливими до дії різноманітних цитостатичних препаратів, таких як цитозину арабінозид. Хоча і в цьому випадку дані, отримані різними вченими є досить суперечливими. Поясненням цього, швидше за все є те, що всі вони використовували GM-CSF паралельно з іншими препаратами.
Було помічено, що призначення GM-CSF збільшує циркуляцію гемопоетичних клітин-попередників у периферійній крові. Ці клітини в змозі відновити гемопоез після великої дози хімотерапії. Shea вживав високі дози карбоплатину для пацієнтів з різноманітними солідними пухлинами і потім призначав або GM-CSF окремо, або GM-CSF з підтримкою ПCК. ПCК забиралися після стимуляції GM-CSF. Було відмічено незначне зменшення часу, потрібного на відновлення нейтрофілів, та значне покращення у відновленні тромбоцитів і зниження показів до переливання тромбоцитів [23].
Під час лікування високими дозами хіміотерапії з аутогенною трансплантацією кісткового мозку (АТКМ) для лікування лімфоїдних пухлин, післятрансплантаційне введення GM-CSF спричиняє зменшення періоду нейтропенії з явним зменшенням кількості днів, коли у пацієнта спостерігається лихоманка, та часу перебування в лікарні. Уцілому зменшення тривалості нейтропенії у нормі становило 2-3 дні, і подальше зменшення було б іще більшим успіхом [цит. по 10].
Коли АТКМ проводиться в комбінації з введенням ПCК, стимульованими GM-CSF, приживлення відбувається швидше і також значно підвищується відновлення тромбоцитів. Bennett, використовуючи GM-CSF для пацієнтів, які отримують високі дози хіміотерапії і відновлення кровотворення за допомогою АТКМ і/або ПCК, відзначив пряму вигоду для пацієнтів від використання GM-CSF у вигляді деякого зменшення кількості днів перебування у лікарні, використання антибіотиків та використання інших агресивних тестів та процедур. Вони також підрахували виграш у витратах при використанні GM-CSF, хоча не відомо, чи було включено ціну самого GM-CSF [7]. Link виявив, що GM-CSF вкорочує час відновлення нейтрофілів, зменшує ймовірність бактеріальної інфекцїї і зменшує час ізоляції для пацієнтів, яким зроблено АТКМ для лікування гострої лімфобластної лімфоми чи не ходжкінські лімфоми [18].
Метою стимуляції СКПК є добути з периферійної крові стільки клітин-попередників, скільки можливо, проте нормальні умови для досягнення цього поки що не визначені. Важливим є те, що пацієнти повинні пройти мінімальний курс лікування і мати добрі резерви кісткового мозку. У деяких з цих досліджень використовували циклофосфамід, який також відомий як стимулятор мобілізації ПCК, і має відносно м’якший цитотоксичний ефект на стовбурові клітини, ніж GM-CSF. У таких умовах вихід ПCК набагато більший, і виздоровлення від цитопенії, спричиненої циклофосфамідом, відбувається раніше.
Алогенна трансплантація кісткового мозку є іншою галуззю, де досліджувався вплив GM-CSF. У подвійному рандомізованому сліпому експерименті призначався рекомбінантний GM-CSF людини або плацебо пацієнтам, яким проводилась алогенна трансплантація кісткового мозку для лікування лейкемій. Деякі з них хворіли на мієлобластну лейкемію. Було помічено, що середня кількість нейтрофілів на 14 день була набагато вищою у групи, яка отримувала препарат, ніж у групи, яка отримувала плацебо (1.9х109/літр проти 0.46х109/літр), проте час, протягом якого кількість нейтрофілів відновлювалась до рівня >0.5x109, значно не вкорочувався. Це може бути завдяки його низькій ефективності та малій кількості пацієнтів. Не було посилення проявів симптому “трансплантант проти господаря”, хоча у групи, що отримувала GM-CSF спостерігався підвищений рівень лімфоцитів між 10 та 15 добою. Важливим було те, що не було випадків того, що лікування збільшує ризик лейкемічних рецедивів, не зважаючи на те, що найдовший період спостереження при цьому був 18 місяців. Виживання серед пацієнтів обох груп було однаковим, проте в подальшому лише 30% процентів доживали до 5 місяців (з обох груп), що досить важко піддаєтья поясненню [18].
При іншому спостереженні використовували GM-CSF при трансплантації кісткового мозку, вільного від Т-лімфоцитів, пацієнтам, частина з яких хворіла на мієлоїдну лейкемію. Завдяки препарату було вкорочено час, необхідний для відновлення нейтрофілів, а також знижено смертність від інфекцій та інші посттрансплантаційні ускладнення, хоча це не стало закономірністю. Випадки бронхопневмонії та обсяги використання антибіотиків зменшились у групі, що отримувала GM-CSF [11].
Потенційно важливими є спостереження того, що GM-CSF можна використовувати для покращення стану хворих, яким було невдало зроблено алогенну трансплантацію кісткового мозку. Раніше єдиною надією для таких пацієнтів була повторна трансплантація, як правило з невтішними результатами. Можливо, в майбутньому GM-CSF займе належне місце в лікуванні таких пацієнтів.
Хворі з вірусом імунодифіциту людини (ВІЛ), поряд із багатьма проблемами, що стосуються дисфункції Т-лімфоцитів, мають ряд інших гематологічних негараздів, частина з яких може бути ятрогенними. Різноманітні цитопенії можуть виникати завдяки ВІЛ-спричиненій інфекції самі по собі. Це може бути підсилене деякими ліками, такими як зидовудин. Іншими проблемами цих пацієнтів є ретиніт, спричинений вірусом цитомегалії, що часто призводить до сліпоти. Лікування цих станів вимагає використання антивірусного агента ганцикловіру, що в свою чергу може призвести до мієлосупресії. Пацієнтам, в яких вже кількість клітин крові знижена, доза ганцикловіру повинна бути зменшена з відповідною втратою ефективності [цит. по 10]. Досить важливо є знайти засоби подолання цієї проблеми.
У першій частині досліджень GM-CSF, що вводили хворим на СНІД, спричиняв збільшення кількості периферійних нейтрофілів та еозинофілів, а також помірне підвищення рівня моноцитів. Покращувалась також функція нейтрофілів. У плазмі спостерігалось збільшення рівня ВІЛ р-24 антигену, який знову знижувався під час наступних циклів лікування. Гематологічна токсичність GM-CSF виявилася нижчою, ніж терапія з використанням зидовудину. Було відзначено роль GM-CSF у лікуванні нейтропенії, індукованої ганцикловіром [17].
На теперішній час існує 4 рекомбінантних мієлоїдних фактори росту-2 гранулоцитарно-макрофагальних (сарграмостим і малграмостим) і 2 гранулоцитарних (філграстим і ленограстим). Для отримання сарграмостима використовували клітини дріжджів, малграмостима і філграстима – клітини E.coli, ленограстима – клітини яєчника китайського хом’ячка.
2.3. Граноцит як рекомбінантна форма гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Усі природні фактори росту є глікопротеїнами. З трьох зареєстрованих і дозволених для використання в Європі мієлоїдних факторів росту, GM-CSF (лейкомакс) і G-CSF (нейпоген) – не глікозильовані, оскільки їх молекула в процесі рекомбінантного отримання втратила цукор; G-CSF (граноцит) – глікозильований, тобто, подібно до природних факторів росту, є глікопротеїном.
Граноцит складається із 174 амінокислотних залишків, що утворюють один поліпептидний ланцюг, у 133-й позиції якого, так як і у природного G-CSF, до триптофану приєднано цукор. Молекулярна маса граноцита біля 20кДа. Показано, що по структурі і активності граноцит ідентичний натуральному G-CSF людини.
Доведено високу ефективність граноцита при нейтропенії: було показано, що у хворих із солідними пухлинами після хіміотерапії медіана тривалості нейтропенії з кількістю лейкоцитів < 1.0x109/літр у групі, що отримувала плацебо складає від 8.5 до 9.5 дні, у той час, як у хворих, що отримували граноцит, період лейкопенії коротший – всього 2 чи 3 дні, в залежності від дози препарату [цит. по 2].
Порівняння ефективності граноцита і GM-CSF у боротьбі з нейтропенією у хворих, що отримали високі дози циклофосфана, показало швидше відновлення показників гранулоцитопоеза при використанні граноцита.
У великому рандомізованому дослідженні, що включало 120 хворих на рак молочної залози, які отримували інтенсивну хіміотерапію, продемонстровано, що число бактеріологічно доведених інфекцій у групі хворих, які отримували граноцит, склало 8%, а в контрольній групі – 22% [цит. по 2].
Швидкість відновлення кількості нейтрофілів корелює з періодом перебування хворих у стаціонарі. По даним H.Link, у групі хворих, які отримали граноцит, кількість нейтрофілів до 28-го дня після трансплантації кісткового мозку перевищила 1.0х109/літр у 88%; а середній час перебування в стаціонарі склав 25 днів; у групі, що отримала плацебо, кількість гранулоцитів відновилась до 28-го дня лише у 44% хворих, середній час перебування в стаціонарі склав 36 днів [18].
Для боротьби з цитостатичною нейтропенією граноцит починають застосовувати через 44 – 48 годин після закінчення курсу хіміотерапії і продовжують до тих пір, поки кількість лейкоцитів складатиме не менше 1.0х109/літр, що повинно бути зафіксовано трьома послідовними аналізами. Таке лікування у більшості хворих не запобігає розвитку лейкопенії, але скорочує її тривалість; звичайно необхідність призначення граноцита зберігається протягом 8 – 10 днів. У деяких пацієнтів кількість лейкоцитів збільшується дуже швидко, досягаючи 10 – 15х109/літр і більше протягом кількох днів, однак відміна препарату призводить у цих випадках до швидкої нормалізації кількості лейкоцитів. При високодозовій хіміотерапії і трансплантації кісткового мозку тривалість лікування граноцитом складає 14 - 25 днів. У ряді випадків після відміни граноцита настає перехідна лейкопенія, що не супроводжується розвитком інфекційних ускладнень [цит. по 2].
Призначення граноцита одночасно з хіміотерапією не запобігає нейтропенії, а може навіть поглибити її. Це пов’язано з тим, що велика кількість гранулоцитарних попередників, що вступають під впливом G-CSF у проліферативний цикл, опиняються під впливом хіміотерапії.
2.4. Еритропоетин. Еритропоетин (EPO) застосовувався при лікуванні термінальної стадії ниркової недостатньості при діалізі з наслідками у вигляді збільшення рівня гемоглобіну, зменшення симптомів анемії та зниженні показів до переливання крові. EPO може відігравати важливу роль у лікуванні цих паціентів, якщо в них низький рівень власного EPO.
Не зовсім зрозуміла ситуація у інших випадках, коли рівень ендогенного EPO нормальний або підвищений. Проводилися дослідження з пацієнтами, в яких були різні форми мієлом та інші типи злоякісних новоутворень кісткового мозку. Не зважаючи на високі рівні циркулюючого ендогенного EPO та низькі резерви кісткового мозку, було показано, що еритропоез може бути підсилений введенням додaткового екзогенного EPO. Це призводить до зменшення кількості симптомів хвороби та зменшення вимог до переливання крові. Ці покращення були, як правило, незначні, і частими були випадки виникнення тромбозів [20]. Не схоже на те, що EPO знайде собі застосування в лікуванні таких паціентів.
Інші хвороби, при яких застосовували EPO, включали ВІЛ інфекції. Було відмічено відступ анемії, спричиненої терапією з використанням зидовудину із зниженням вимог до переливання крові. Зафіксовано також покращення стану пацієнтів із ревматоїдними артритами та хронічною анемією.
Потенційною можливістю застосування EPO в майбутньому є використання його при зборі крові у пацієнтів перед операцією. Специфічні релігійні організації, такі як Свідки Єгова, під впливом певних обставин не заперечують проти лікування з використанням EPO. Riggs застосовував введення EPO членам цієї секти, які мали анемію, перед операціями на серці з добрими результатами. Застосовувалось також використання EPO для лікування хворих, у яких була підвищенна кількість антитіл проти власних еритроцитів та анемія хронічної форми, що вимагала хірургічного втручання. Кількість еритроцитів збільшилась завдяки введенню EPO, незалежно від переливання еритроцитної маси. Інші стани, що спричиняють хронічну анемію, такі як серповидноклітинна анемія, можуть також бути ймовірними кандидатами до застосування EPO. Терапія з використанням EPO добре переноситься [цит. по 2].
Важливим є те, що рекомбінантний EPO дуже схожий на той, що виробляється клітинами ссавців, тому їх важко розрізнити. Тому можливим є його незаконне використання, наприклад атлетами, щоб збільшити кількість еритроцитів та їх здатність переносити кисень. Це може призвести також до збільшення в’зкості крові, що є досить небезпечним.
2.5. Інші ростові фактори. Макрофагальний колонієстимулюючий фактор (M-CSF) є відносно специфічним моноцитарно-макрофагальним ростовим фактором, виділеним із сечі людини. Рекомбінантний M-CSF вперше було отримано в клітинах мавпи Kawasaky. Обидва вони мають ідентичні властивості. M-CSF стимулює диференціацію клітин кісткового мозку в моноцитарно-макрофагальні колонії, а також підвищує продукцію моноцитами інтерферону та протипухлинного фактору [17].
Однією досить цікавою областю застосування M-CSF є боротьба з грибковими інфекціями. У більшості хворих спостерігалося послаблення або повне зникнення інфекції, включаючи двох, у яких був резистентний печінковий кандидоз, що було доведено за допомогою біопсії [8]. У тих пацієнтів, які отримували M-CSF після трансплантації кісткового мозку, не було загострення синдрому “трансплантант проти господаря”. M-CSF можна використоувати для полегшення стану пацієнтів із пригніченою функцією імунної системи, а також тих, у кого прогресує грибкова інфекція.
Є повідомлення про успішне подвійне сліпе рандомізоване дослідження із застосуванням M-CSF при аутогенній та ізогенній трансплантації кісткового мозку у хворих на лейкемію. Рівень гранулоцитів у крові нормалізувався раніше у групи, що отримувала M-CSF, хоча і повернувся до початкової позначки через 2–3 дні. Не було загострення синдрому “трансплантант проти господаря” та лейкемічних рецидивів [цит. по 10].
Інтерлейкін-2 (IL-2) є сильнодіючим фактором росту Т-лімфоцитів, що синтезується антиген-специфічними Т-клітинами і взаємодіє із специфічним IL-2R або ТАС-антигеновим рецептором. Можливо існує ще один рецептор з молекулярною масою 75кДа, що забезпечує взємодію M-CSF із клітиною. Результати перших дослідів показали, що у меншої частини пацієнтів спостерігався регрес пухлини, коли використовували сам M-CSF, чи комбінацію його з лімфоцитами, активованими in vitro за допомогою IL-2 (лімфокін активовані кіллери або LAK клітини). Було відмічено сильну їх токсичність, що часто загрожувала життю, пов’язану із виникненням крихкості капілярів при високих дозах, гіпотонією та легеневими набряками. Лише у незначної частини пацієнтів спостерігалася часткова ремісія. Використання IL-2 у нижчих дозах та з іншими режимами призначення може зменшити токсичність [8].
IL-2 використовувався у клінічних дослідженнях для індукції LAK клітин. IL-2 разом із LAK клітинами або самостійно використовувався переважно при карціномах нирок та злоякісних меланомах. Позитивні результати становили 20-30%, більшість з яких були частковими, що свідчить про низьку доцільність клінічного використання препарату, зважаючи на те, що препарат сам по собі є токсичним [8].
Іншим цікавим підходом до використання IL-2 є активація аутогенних лімфоцитів, відфільтрованих від ракових клітин (TIL), як форма адаптивної клітинної імунотерапії. Описано визначну антипухлинну активність застосування TIL із IL-2 проти клітин карціноми нирок in vitro.
Інші можливості використання включають застосування IL-2 в комбінації з іншими біологічно активними речовинами, такими як інтерферон, IL-4 і IL, для отримання користі з можливості цих агентів активувати рецептори до IL-2. Моноклональні антитіла проти пухлин також можуть підсилювати антипухлинну активність IL-2. Можливо також те, що IL-2 може використовуватись для підсилення ефекту “трансплантант проти лейкемії”, що спостерігалося при алогенній трансплантації кісткового мозку.
Недавно було описано властивості ще одного фактора росту – інтерлейкіну-1(IL-1). Перша частина досліджень показала побічні ефекти, що виникають під час його застосування: підвищення температури, відчуття холоду, головна біль, гіпертонія, тошнота, блювання, біль у м’язах та суглобах. Можливо його потрібно використовувати в комбінації з GM-CSF або у IL-2/LAK комбінації. Інші можливості включають використання антагоністів до IL-1 рецепторів, що в дослідах на тваринах продемонструвало захист від інфекцій та зниження проліферації мієлоїдних лейкемічних клітин in vitro [12].
Інтерлейкін-3 (IL-3, Multi-CSF, CSF-2a, CSF-2b, hematopoetin 2) є мультипотенційним ростовим фактором, чиї властивості частково співпадають із GM-CSF, хоча IL-3 краще діє на менш зрілі клітини-попередники. Доклінічні дослідження на тваринах показали, що IL-3 у комбінації з GM-CSF, може підвищувати рівень СКПК у периферійній крові та покращувати приживлення кісткового мозку після трансплантації. Alter відкрив, що застосування IL-3 in vivo прискорює відновлення ПCК і збільшує розмір та кількість колоній стовбурових клітин кісткового мозку. IL-3 використовували у комбінації з GM-CSF [5]. У частині другій досліджень Dunbar призначав спочатку GM-CSF, а потім IL-3, з перервою у 8 тижнів пацієнтам із мієлодисплазією. Було помічено, що IL-3 мав схожу з GM-CSF активність щодо термінів збільшення рівня нейтрофілів і не мав впливу на зниження кількості тромбоцитів (на відміну від GM-CSF). Ті ж учені використовували IL-3 для покращення стану пацієнтів із іншою формою анемії в одночасній комбінації з GM-CSF. Обидва фактори покращували еритропоез, хоча IL-3 відводилася головніша роль. Токсичність IL-3 зумовлювала виникнення у пацієнтів нудоти, втоми, що не зникали при зниженні дози препарату. Було порівняно ефект застосування комбінації IL-3 та GM-CSF та застосування чистого IL-3 у пацієнтів із різноманітними пухлинами. Комбінація була ефективнішою щодо стимуляції гемопоезу і дозволяла вкоротити тривалість лікування завдяки позитивному впливу IL-3 на тромбопоез [15].
При лікуванні хворих із мієлодиспластним синдромом та апластичною анемією відзначалась різноманітність отриманих результатів. У багатьох пацієнтів було досягнуто підвищення рівня лейкоцитів та тромбоцитів. Токсичність була незначною, загальний рівень гістаміну в крові не піднявся [цит. по 10].
IL-3 використовувався для лікування пацієнтів із мієлодиспластним синдромом і призводив до підвищення утворення клітин крові всіх ліній, хоча вплив на еритропоез був дещо нижчий. Двоє з чотирьох хворих із важкою формою тромбоцитопенії покращило свій стан до рівня, коли вже можна відміняти переливання тромбоцитарної маси. Побічні ефекти були мінімальними [8].
Іншим можливим простором для застосування IL-3 могло б бути відновлення кісткового мозку після хіміотерапії, хоча зараз немає достатньо інформації стосовно цього. Існує думка, що IL-3 може стимулювати клональний ріст злоякісних новоутворень, таких як рак легень [8].
Інтерлейкін-4 (IL-4) вже пройшов кілька стадій досліджень. Є цікаві доклінічні дані, які свідчать про те, що він має антиракові властивості або відіграє роль у довготривалій антипухлинній резистентності. Було показано роль рекомбінантного IL-4 людини у вигляді позитивного впливу на перебіг захворювання у пацієнтів із резистентною формою хвороби Ходжкіна після провалу високодозової хіміотерапії та аутотрансплантації кісткового мозку. Переважаючими побічними ефектами було виникнення гарячки, головні болі, затримка рідини в організмі та підвищення рівня лужної фосфатази. Розробляється метод застосування комбінації IL-4 та IL-2 з використанням TIL. Експерименти іn vivo з використанням лімфоцитів пацієнтів, які отримали IL-2, показали, що IL-4 може підсилювати індуковану IL-2 або антитілами проліферацію лімфоцитів. З цього можна зробити висновок про можливу роль IL-4 у збільшенні проліферації TIL та продукції LAK ex vivo [8]. Іншим ситуаціями, при яких можливе застосування препарату є атопія, аутоімунні реакції та запальні процеси.
Інтерлейкін-6 (IL-6) є сильнодіючим цитокініном, що регулює гемопоез та імунні реакції організму. Спочатку він називався 2-інтерферон, стимулюючий фактор-2 В-лімфоцитів і т.п. Вже проведено дослідження його властивостей in vitro, але клінічних досліджень іще не було. Викликає цікавість можливість його застосування при різноманітних новоутвореннях, таких як мієлома.
Фактор стовбурових клітин (SCF) є малоописаним ростовим фактором, дія якого спрямована на посилення проліферації ранніх попередників гемопоетичних клітин, особливо за присутності факторів росу, таких як IL-6, IL-3 і G-CSF [8].
Інтерлейкін-9 (IL-9) було виділено із лінії Т-клітин гризунів родини Muridae. Пізніше було встановлено, що ген, який його кодує, знаходиться у людини на 5-й хромосомі. IL-9 сприяє формуванню еритроїдних колоній. IL-9 людини було виділено з мегакаріобластних лейкемічних клітин. Він може пригнічувати розвиток деяких злоякісних новоутворень кровотворної тканини. Можливо, що після подальших досліджень ролі IL-9 в цих процесах, виникне можливість його застосування при трансплантаціях кісткового мозку та терапії раку [13].
Інтерлейкін-11 (IL-11) було виділено з кісткового мозку приматів. У комбінації з IL-6 він може підтримувати відновлення мегакаріоцитів після хіміотерапії та стримувати розвиток деяких пухлин [12].
Висновки
Ростові фактори є великою групою гормонів, що діють на всі лінії гемотопоетичних клітин. Наявність на клітинах-попередниках рецепторів до якогось певного типу ростових факторів дає змогу використовувати їх для збільшення кількості клітин крові якоїсь окремої лінії. Дослідження гемопетичних ростових факторів вносить нове у розуміння механізмів гемопоезу. Багато їх властивостей забезпечують їм широке застосування при різних клінічних ситуаціях.
EPO і G-CSF знайшли собі місце при лікуванні різноманітних захворювань. Основною сферою їх використання є збільшення ефективності протиракової терапії, де вони відіграють значну роль. Роль GM-CSF ще до кінця не зрозуміла; висока токсичність робить його менш привабливим засобом лікування нейтропеній та нейтропенійних сепсисів, проте його біологічна активність забезпечує йому інші потенційно можливі сфери застосування, наприклад для виведення клітин-попередників із кісткового мозку до периферичної крові. Застосування комбінацій ростових факторів відіграє величезну роль у лікуванні цитопеній (особливо нейтропеній), спричинених хіміотерапією. Перспективним є відновлення гемопоезу та боротьба із злоякісними новоутвореннями з використанням комбінацій різних інтерлейкінів та GM-CSF. Ростові фактори також можна застосовувати при різних хворобах, що не пов’язані з виникненням пухлин. Очікується збільшення їх ролі в лікуванні СНІДу. Як тільки відкриються нові особливості біології цитокінінів та ростових факторів, відбудеться подальше розширення їх застосування.
Список використаної літератури.
1.Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж.// Молекулярная биология клетки: Пер. с англ.– М.: Мир, 1994.– с.176-186.
2.Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и его клиническое использование// Терапевтический архив.– 1998.– № 4. С.80-84.
3.Дэвид Г., Натан. Регуляция кроветворения// Гематология и трансфузиология.–1994.– 39, № 2.– С.56-60.
4.Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я.// Клеточные основы кроветворения: – М.: ”Медицина”,1977.
5.Alter R, Welniak LA, Jackson JD et al., In-vitro clonogenic monitoring of peripheral blood stem cell collection following interleukin-3 administration// Blood .– 1990.–76 (suupplement 1).– P. 129a.
6.Antman KS, Griffin JD, Elias A et al., Effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on chemotherapy-indused myelosuppression// New England Journal of Medicine.– 1988.– № 319.– P. 593-598.
7.Bennett CL, Greenberg P, Gulati SC, Advani R & Bonnem E. GM-CSF decreases duration of cytopenia and hospitalization, and in-hospital costs in patients with Hodgkin’s disease treated with high-dose chemotherapy and autologous bone marrow transfusion (ABMT)// Blood.– 1990.–76 (supplement 1).– P. 132a.
8.Borden EC & Sondel PM. Lymphokines and cytokines as cancer treatment// Cancer.– 1990.– 65.– P. 800-814.
9.Crawford J, Ozer H, Stoller R et al. Reduction by granulocyte colony-stimulating factor of fever and neutropenia-indused by chemotherapy in patients with small-cell lung cancer// New England Journal of Medicine.–1991.– № 325.– P. 164-170.
10.Davis I, Morstyn G. Clinical uses of growth factors// Bailliere’s Clinical Haematology.– 1992.– 5, № 3.– P. 353-377.
11.De Witte T, Gratwohl A, Van Der Lely N et al. A multicentre double blind randomized trial of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in recipients of allogeneic T-cell depleted bone marrow// Blood .– 1990.–76 (supplement 1).– P. 139.
12.Dinarello CA. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism// Blood.– 1991.– 77.– P. 1627-1652.
13.Donahue RE, Wang EA, Stone DK et al. Stimulation of hematopoiesis in primates by continuous infusion of human GM-CSF// Nature.– 1986.– № 321.– P. 872-875.
14.Douer D, Sagi O, Shaced N, Witz IP & Ramot B. Response to recombinant murine GM-CSF in melphalan treated mice// Blood.– 1987.– 70 (supplement 1).– P. 133.
15.Dunbar CE, Smith D, Kimball J et al. Sequential treatment with recombinant human growth factors to compare activity of GM-CSF and IL3 in the treatment of primary myelodysplasia// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 141.
16.Dunbar CE, Smith D, Kimball J et al. Hematopoietic growth factor treatment of Diamond-Blackfan anemia// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 143.
17.Kawasaki ES, Ladner MB, Wang AM et al. Molecular cloning of a complementary DNA encoding human macrophage-specific colony-stimulating factor// Science.–1985.– 230.– P. 291-296.
18.Link H, Boogaerst M, Carella A et al. Recombinant human GM-CSF after autologous bone marrow transplantation for acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin’s lymphoma: a randomized double blind multicenter trial in Europe// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).– P. 152.
19.Mayer P, Lam C, Obenaus H et al. Recombinant human GM-CSF induses leukocytosis and activates peripheral blood polymorphonuclear neutrophils in nonhuman primates// Blood.– 1987.– 70.– P. 206-213.
20.Miller CB, Platanias LC, Ratain MG et al. A phase I/II trial of erythropoietin in the treatment of chemotherapy-indused anemia// Blood.– 1990.–76 (supplement 1).– P. 156.
21.Ohno R, Tomonaga M, Kobayashi T et al. Effect of G-CSF after intensive induction therapy in relapsed of refractory acute leukemia// New England Journal of Medicine.– 1990.– 323.– P. 871-877.
22.Potter MN, Mott MG, Oakhill A. The successful tratment of a case of very severe aplastic anemia with GM-CSF and antilymphocyte globulin// British Journal of Haematology.– 1990.–75.– P. 618-619.
23.Shea TC, Mason JR, Storniolo Am et al. Beneficial effect from sequential harvesting and reinfusing of peripheral blood stem cells in conjunction with rHU GM-CSF and high dose carboplatin// Blood.– 1990.– 76 (supplement 1).–P. 165.
24. Welte K, Bonilla MA, Gillio AP et al. Recombinant human G-CSF: effects on hematopoiesis in normal and cyclophosphamide-treated primates// Journal of Experimental Medicine.–1987.–165.– P. 941-948.
25.Welte K, Zeidler C, Pietsch T et al. Correction of neutropenia in children with glycogenosis Ib by treatment with rhG-CSF// Blood.–76 (supplement 1).– P. 171.
